Estudo do efeito de poliânions na formação e estabilidade da transição de fase líquido-líquido da proteína M2-1 do hRSV - Leal, Diego Evaristo [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é uma das principais causas de infecções respiratórias agudas, como bronquiolite e pneumonia, condições que apresentam alto risco, especialmente em lactentes durante o primeiro ano de vida e em idosos com comorbidades. Entre as proteínas virais, a M2-1 desempenha papel crucial no suporte à transcrição, estabilizando a RNA polimerase e sendo essencial para a expressão gênica viral. A replicação do hRSV ocorre em estruturas citoplasmáticas denominadas corpos de inclusão, formadas por um processo conhecido como separação de fases líquido-líquido (LLPS), no qual proteínas virais e RNA se organizam em um microambiente concentrado que favorece a transcrição e a replicação. A proteína M2-1 é capaz de formar LLPS de forma independente e, na presença de RNA, gerar coacervados proteína–RNA. Ela também interage com as proteínas N e fosfoproteína (P) do vírus, modulando o tamanho dos condensados por meio de sua ligação com P. Este estudo teve como objetivo investigar como a M2-1 sofre separação de fases e como diferentes moléculas polianiônicas como RNA, heparina, suramina, condroitina A e enoxaparina influenciam esse comportamento. M2-1 recombinante foi produzida com sucesso em Escherichia coli cultivada em meio LB e purificada com alto rendimento e pureza. O processo de separação de fases foi analisado por espectroscopia UV-Visível a 370 nm, associada à microscopia de campo claro. Resultados iniciais mostraram que o aumento da concentração de M2-1 elevou a turbidez, efeito significativamente intensificado na presença de 5% (m/v) de polietilenoglicol, sugerindo que esse agente de aglomeração molecular favorece a LLPS de M2-1. Moléculas polianiônicas intensificaram a formação de LLPS até uma razão próxima da equimolaridade entre a proteína e os poliânions, a partir da qual a separação de fases diminuiu abruptamente para RNA de leveduras, heparina e enoxaparina. Quanto à suramina, o processo de separação de fase líquido-líquido apresentou um declínio relevante apenas em uma concentração de 1:4 entre a proteína e o poliânion, e a condroitina A não demonstrou disrupção do processo de LLPS. Assim, estes achados oferecem novos insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes à LLPS da M2- 1 do hRSV no contexto da ligação a poliânions, destacando o potencial das moléculas polianiônicas em interferir na formação dos corpos de inclusão virais. A compreensão aprofundada desses processos pode orientar o desenvolvimento de estratégias antivirais inovadoras voltadas ao controle da organização física da maquinaria de replicação viral.

Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the main causes of acute respiratory infections, such as bronchiolitis and pneumonia, conditions that present high risk in infants during the first year of life and in elderly individuals with comorbidities. Among the viral proteins, M2-1 plays a crucial role in supporting transcription, stabilizing RNA polymerase and being essential for viral gene expression. hRSV replication occurs in cytoplasmic structures called inclusion bodies, formed through a process known as liquid–liquid phase separation (LLPS), in which viral proteins and RNA organize into a concentrated microenvironment that favors transcription and replication. The M2-1 protein is capable of forming LLPS independently and, in the presence of RNA, generating protein–RNA coacervates. It also interacts with the N protein and the viral phosphoprotein (P), modulating condensate size through its binding to P. This study aimed to investigate how M2-1 undergoes phase separation and how different polyanionic molecules such as RNA, heparin, suramin, chondroitin A, and enoxaparin influence this behavior. Recombinant M2-1 was successfully produced in Escherichia coli grown in LB medium and purified with high yield and purity. The phase separation process was analyzed by UV-Visible spectroscopy at 370 nm, combined with bright-field microscopy. Initial results showed that increasing the concentration of M2-1 elevated turbidity, an effect significantly intensified in the presence of 5% (w/v) polyethylene glycol, suggesting that this molecular crowding agent favors M2-1 LLPS. Polyanionic molecules enhanced LLPS formation up to a ratio close to equimolarity between the protein and the polyanions, from which phase separation sharply decreased for yeast RNA, heparin, and enoxaparin. As for suramin, the liquid–liquid phase separation process showed a relevant decline only at a 1:4 concentration between the protein and the polyanion, and chondroitin A did not demonstrate disruption of the LLPS process. Thus, these findings offer new insights into the molecular mechanisms underlying hRSV M2-1 LLPS in the context of polyanion binding, highlighting the potential of polyanionic molecules to interfere with the formation of viral inclusion bodies. A deeper understanding of these processes may guide the development of innovative antiviral strategies aimed at controlling the physical organization of the viral replication machinery.
Study of the effect of polyanionc molecules on formation and stability of liquid-liquid phase separation of M2-1 protein from hRSV
Keywords: hRSV; M2-1; Poliânions; Condensados Líquidos; Vírus Sincicial Respiratório Humano; Respiratory Syncytial Virus, Human; Viral proteins