Uma abordagem neuroproteômica do cérebro de operárias de Apis mellifera africanizadas submetidas ao ensaio de reflexo de extensão de probóscide - Menegasso, Anally Riberio da Silva [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017)
Atualmente, as abelhas têm sido utilizadas como modelos de aprendizagem e memória, destacando a sua utilidade para a neurociência, em particular para o melhor entendimento das bases da cognição. Para isso, o reflexo de extensão de probóscide (REP) é um estímulo incondicionado (US) amplamente utilizado para acessar a habilidade das abelhas para correlacioná-la com um estímulo condicionado (CS) durante a aprendizagem e aquisição de memória. No presente estudo REP foi utilizado para estudos proteômicos do cérebro de abelhas por meio de diversas estratégias inovadoras. Proteômica shotgun foi aplicada ao estudo de proteínas solúvel em sistema µLC-ESI-micrOToF-QIII e quantificação label-free em sistema LTQ-Orbitrap XL ETD, sendo o primeiro estudo de análise proteômica que chama atenção para o fato de que o comportamento reflexo (não-condicionado - US) por si só ativa diversas cascatas metabólicas, incluindo processos biológicos relacionados à memória. A análise comparativa dos perfis proteômicos para os cérebros de operárias do grupo controle e do grupo REP demonstraram uma ativação do metabolismo de compostos cíclicos/heterocíclicos/aromáticos em paralelo com o metabolismo de compostos nitrogenados. Este processo seguiu-se pela regulação negativa de proteínas envolvidas no metabolismo de metabólitos fosforilados e a regulação positiva das proteínas relacionadas com o metabolismo dos carboidratos. Isto provavelmente ocorreu para fornecer energia metabólica para os processos celulares necessários para adaptar o cérebro ao REP. Além disso, foi realizada a análise do transcriptoma de cérebro de abelhas forrageiras (naive), a qual foi utilizada na criação de um banco de dados que reuniu as sequências depositadas no Uniprot, NCBI e sequências obtidas pela análise de transcriptoma. O estudo do proteoma de membrana em cérebro de abelhas submetidas a REP e REP-condicionado, com quantificação label em sistema LTQ-Orbitrap XL ETD permitiu a identificação de um total de 6.882 proteínas, dentre as quais 1.582 são proteínas de membrana e 658 apresentaram diferença de expressão entre os grupos controle, REP e REP-condicionado. Diversos importantes processos do sistema nervoso foram detectados, tais como proteínas envolvidas na transdução olfativa, proteínas de sinapse GABAérgica, colinérgica, dopaminérgica, serotonérgica, glutamatérgica, dentre outros importantes receptores neuronais. Fica claro que se trata de um processo multicomplexo que exige a expressão/síntese de proteínas e a transdução de diferentes sinais. Sugere-se que as rotas mais correlacionadas com o processo de memória associativa (REP-condicionado vs REP) em comparação à REP vs controle sejam a transdução olfativa, sinapse dopaminérgica, sinapse glutamatérgica e sinapse GABAérgica. No caso de recuperação de memória previamente adquirida, a sinapse colinérgica (acetilcolina) parece ser de fundamental importância para o grupo REP. Estudos de validação estão sendo empregados para a melhor compreensão destes processos. Por fim, a análise proteômica in situ de neuropeptídeos por MALDI Imaging. Para os neuropeptídeos apidaecina, NPLP-1, SIFamide os resultados obtidos sugerem à baixa detecção de peptídeos nos indivíduos de REP com a rápida liberação e utilização dessas biomoléculas na modulação dos processos biológicos estudados, corroborando com a hipótese de que a memória e aprendizagem olfativa estão mais intimamente relacionadas com os cálices. Já para os neuropeptídeos Alatostatinas e Taquicininas, a intensa marcação desses neuropeptídeos no grupo REP, sugere a síntese de neuropeptídeos através da degradação enzimática de novos precursores protéicos presentes nessas regiões do cérebro. A partir das diferentes estratégias metodológicas aplicadas esperase ter contribuído para a compreensão da neurociência em nível de proteínas e peptídeos, e seu papel nas interações moleculares e formação de memória em abelhas.

Nowadays, bees have been used as models in studies of learning and memory, highlighting their utility for neuroscience, in particular for a better understanding of the bases of cognition. For this, proboscis extension reflex (PER) is an unconditioned stimulus (US) widely used to access bees' ability to correlate it with a conditioned stimulus (CS) during learning and memory acquisition. In the present study, PER was used for proteomic studies of bees brain through several innovative strategies. Proteomic shotgun was applied to the study of soluble proteins in μLC-ESI-micrOToF-QIII system and label-free quantification in LTQ-Orbitrap XL ETD system, being the first proteomic analysis study that draws attention to the fact that reflex behavior (US) alone activates various metabolic cascades, including biological processes related to memory. The comparative analysis of the proteomic profiles for the workers' brains from control group and REP group demonstrated metabolism of cyclic / heterocyclic / aromatic compounds in parallel with the metabolism of nitrogen compounds. This process was followed by the negative regulation of proteins involved in metabolism of phosphorylated metabolites and the positive regulation of proteins related to the metabolism of carbohydrates. This has probably occurred to provide metabolic energy for the cellular processes needed to adapt the brain to PER. In addition, the transcriptome analysis of foraging bees brain was performed, which was used in the creation of a database that gathered the deposited sequences in the Uniprot, NCBI and sequences obtained by the transcriptome analysis. The study of membrane proteome in the brain of PER and PER-conditioned bees with label quantification in the LTQOrbitrap XL ETD system allowed the identification of 6,882 proteins, of which 1,582 were membrane proteins and among them 658 presented differential expression between control, REP and REP-conditioned groups. Several important processes of the nervous system have been detected, such as proteins involved in olfactory transduction, synapses GABAergic, cholinergic, dopaminergic, serotonergic e glutamatergic, among other important neuronal receptors. It is clear that this is a multicomplex process that requires the expression / synthesis of proteins and different transduction signals. It is suggested that the routes most correlated with the associative memory process (PER-conditioned vs PER) compared to PER vs control are olfactory transduction, dopaminergic synapse, glutamatergic synapse and GABAergic synapse. In the case of previously acquired memory recovery, the cholinergic synapse (acetylcholine) seems to be of fundamental importance for the PER group. Validation studies are being used to better understand these processes. Finally, it was applied the in situ proteomic analysis of neuropeptides by MALDI Imaging. For the neuropeptides apidaecin, NPLP-1, SIFamide the results obtained suggest the low detection of peptides in REP individuals with the rapid release and use of these biomolecules in the modulation of biological processes studied, corroborating with the hypothesis that, probably, memory and olfactory learning are more closely related to the chalices. For the neuropeptides Alatostatin and Tachykinins, the intense labeling of these neuropeptides in PER group suggests the synthesis of neuropeptides through the enzymatic degradation of new protein precursors present in these regions of the brain. From different methodological strategies applied it is expected to have contributed to the understanding of neuroscience at the level of proteins and peptides, and their role in molecular interactions and memory formation in bees.
A neuroprpteomic approach on worker africanized honeybee Apis mellifera submitted to proboscis extension reflex assay
Keywords: Proteômica; Espectrometria de massas; Memória e aprendizagem; Abelhas; Proteomics; Mass spectrometry; Bees; Memory and learning