Avaliação de genes para o controle do Huanglongbing, obtenção de laranjeiras-doces geneticamente modificadas e genoma completo de ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ do Brasil - Dutra, Michele Fernanda Souza [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
O Huanglongbing (HLB), doença associada às bactérias não cultiváveis ‘Candidatus Liberibacter’, se configura como a doença mais destrutiva dos citrus mundialmente. Não há cura e não existem citros comerciais resistentes ao HLB. O manejo é feito com o plantio de mudas sadias, a inspeção e a erradicação de plantas sintomáticas e o monitoramento e controle do inseto vetor. A obtenção do genoma das liberibactérias proporcionou descobertas valiosas, destacando a presença de genes associados à lise, como lisozimas, e genes de profagos que foram anotados como possíveis bacteriocinas. No presente trabalho, as lisozimas associadas a profago ED07_RS0204515 isolado ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ (CLas) 3PA e CLIBASIA_04790 isolado 4PA, além das possíveis bacteriocinas SC1_gp060 isolados Poona e 2PA e lam_678 do isolado ‘Ca. L. americanus’ (CLam) São Paulo, foram obtidas em células de Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS e utilizadas em sistema de expressão heteróloga. A expressão de lisozima e algumas formas da bacteriocina impediu de forma significativa o crescimento de células de E. coli BL21 em meio líquido e sólido quando comparadas com os controles, com destaque para ED07_RS0204515 e SC1_gp060 Poona. Laranjeiras geneticamente modificadas foram obtidas expressando a lisozima ED07_RS0204515 e as bacteriocinas SC1_gp060 e lam_678, sob o comando do promotor AtSUC2 e 35S CaMV. Os níveis de expressão dos transgenes foram significativos, no entanto, não houve efeito aparente sob os títulos de CLas e CLam quando as plantas foram desafias frente a esses patógenos no sistema proposto. Ainda assim, pelo resultado obtido em células de E. coli, as lisozimas e bacteriocina estudadas no presente trabalho são potenciais para uso como agentes antibacterianos. Por outro lado, o primeiro genoma completo de um isolado de CLas do Brasil, denominado de 9PA, foi obtido. Tal fato permitiu a comparação do genoma deste isolado com os demais disponíveis, revelando Regiões Genômicas Hiper Variáveis (HGRs). A inferência de distâncias genéticas e as investigações sobre essas HGRs presentes nas populações de campo pontuaram que o isolado 9PA se assemelha a isolados das Américas e China, e se configura como um dos três tipos de isolados de maior predominância em campo no Brasil. Adicionalmente, constatouse a presença do profago tipo 1, P-9PA-1, tanto nas formas integrada ao genoma e na forma de plasmídeo circular. Os resultados apresentados ressaltam caraterísticas relevantes para o desenvolvimento de estratégias que visam o controle de liberibactérias patogênicas.

Huanglongbing (HLB), a disease associated with the non-cultivable bacteria 'Candidatus Liberibacter,' stands out as the most destructive citrus disease worldwide. There is no cure, and there are no commercially resistant citrus varieties to HLB. Management involves planting healthy seedlings, inspecting and eradicating symptomatic plants, and monitoring and controlling the vector insect. The sequencing of the liberibacteria genomes has yielded valuable discoveries, highlighting the presence of genes associated with lysis, such as lysozymes, and prophage genes annotated as potential bacteriocins. In this study, lysozymes associated with prophage ED07_RS0204515 from 'Ca. Liberibacter asiaticus' (CLas) 3PA and CLIBASIA_04790 from isolate 4PA, as well as possible bacteriocins SC1_gp060 from strains Poona and 2PA, and lam_678 from 'Ca. L. americanus' (CLam) São Paulo strain, were obtained in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS cells and used in a heterologous expression system. The expression of lysozyme and certain forms of bacteriocin significantly inhibited the growth of E. coli BL21 cells in both liquid and solid media compared to controls, with ED07_RS0204515 and SC1_gp060 Poona standing out. Genetically modified orange trees expressing lysozyme ED07_RS0204515 and bacteriocins SC1_gp060 and lam_678 under the control of the AtSUC2 and 35S CaMV promoters were obtained. The transgene expression levels were significant; however, there was no apparent effect on CLas and CLam titers when plants were challenged with these pathogens in the proposed system. Nevertheless, based on the results obtained in E. coli cells, the lysozymes and bacteriocins studied in this work show potential for use as antibacterial agents. On the other hand, the first complete genome of a CLas isolate from Brazil, named 9PA, was obtained. This allowed the comparison of this isolate's genome with others available, revealing Hyper Variable Genomic Regions (HGRs). Genetic distance inference and investigations into these HGRs in field populations indicated that the 9PA isolate resembles isolates from the Americas and China, representing one of the three most predominant types of isolates in Brazil. Additionally, the presence of prophage type 1, P-9PA-1, was observed both in integrated form within the genome and as a circular plasmid. The presented results emphasize relevant characteristics for the development of strategies aiming at the control of pathogenic liberibacteria.
Evaluation of genes for Huanglongbing control, generation of genetically modified sweet orange trees, and complete genome of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Brazil
Keywords: Citrus; Agentes antimicrobianos; Plantas transgênicas; Genoma; Fago; Antimicrobial agents; Transgenic plants; Genome; Phage