Estudos preliminares de caracterização funcional e bioquímica da proteína NPF, produto da ORF NCU06679 de Neurospora crassa - Miquelin, Vinícius [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
As células dos diversos organismos se adaptam sob diversas condições de estresse ambiental. Para isso, contam com uma maquinaria genética responsável por promover ou silenciar a síntese de proteínas, através da expressão gênica. Este trabalho teve como objetivo principal iniciar com os estudos de caracterização da proteína NPF de Neurospora crassa e estabelecer seu provável envolvimento na regulação da resposta adaptativa do fungo na condição de estresse térmico. NPF é uma proteína que juntamente com outras proteínas tipo Polycomb, participa de um complexo multimérico repressor da expressão genica denominado PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2). Este complexo é conhecido por regular negativamente a expressão genica em plantas, fungos e animais, via trimetilação de resíduos de Lys27 da histona H3 (H3K27me3), levando à formação de heterocromatina facultativa e consequentemente, de um estado transcricional reprimido. Embora ausente nas leveduras, as proteínas PRC2 são altamente conservadas, sendo possível encontrar ortólogos NPF ortólogos em outros organismos, como Drosophila e humanos. NPF foi identificada em N. crassa pelo nosso grupo durante uma abordagem proteômica em busca do fator de transcrição responsável pela modulação negativa da expressão do gene gsn (glicogênio sintase) durante estresse térmico, juntamente com varias outras proteínas, sugerindo que a repressão do gene gsn durante o estresse é altamente regulada, orquestrada por um complexo proteico supramolecular, envolvido tanto no controle transcricional quanto epigenético da expressão. Considerando que a repressão da expressão gênica mediada por H3K27me3 é ainda bastante desconhecida em fungos, e que inicialmente NPF foi descrita estar relacionada ao estresse térmico, aproveitamos o sistema relativamente simples de N. crassa para explorar o possível envolvimento de NPF na resposta adaptativa do fungo ao estresse térmico. Para isto, analisamos o comportamento de uma linhagem de N crassa mutante no gene npf (Δnpf) quando submetida ao estresse térmico (45° C), tendo como controle a linhagem mutante complementada e como background, a linhagem selvagem do fungo. Paralelamente, a linhagem Δnpf foi caracterizada morfologicamente. Nossos resultados demonstraram que a linhagem Δnpf possui um fenótipo defectivo durante o crescimento vegetativo (30° C), tais como conidiação reduzida, baixa produção de carotenoides, micélio com hifas bastante ramificadas, de volumes reduzidos, bordas irregulares e extensões encurtadas e uma taxa de extensão de hifas basais tardia. Quando submetida ao aumento de temperatura, a linhagem Δnfp apresentou crescimento radial drasticamente reduzido. Além disso, ensaios de microscopia de fluorescência usando a linhagem complementada mostraram que NPF se move em direção ao núcleo no choque térmico, corroborando com resultados publicados por nosso grupo e atribuindo a esta proteína para uma possível participação na modulação da expressão genica em condições de estresse. Embora preliminares, nossos resultados são importantes, pois possibilitam atribuir a NPF papel relevante no desenvolvimento vegetativo do fungo e na adaptação de Neurospora ao estresse térmico, contribuindo para um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos fúngica a condições ambientais adversas.

Cells of many organisms adapt to diverse environmental stress conditions by relying on a genetic machinery responsible for promoting or silencing protein synthesis through gene expression. The main objective of this study was to initiate the characterization of the NPF protein in Neurospora crassa and establish its likely involvement in regulating the fungus's adaptive response to heat stress. NPF, along with other Polycomb-like proteins, participates in a multimeric complex that represses gene expression, known as PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2). This complex is known to negatively regulating gene expression in plants, fungi, and animals, through the trimethylation of Lys27 residues of histone H3 (H3K27me3), leading to the formation of facultative heterochromatin and consequently, a repressed transcriptional state. Although absent in yeasts, PRC2 proteins are highly conserved, with orthologs of NPF found in other organisms such as Drosophila and humans. NPF was identified in N. crassa by our group during a proteomic approach to search for the transcription factor responsible for the negative modulation of the gsn (glycogen synthase) gene expression during thermal stress, suggesting that the repression of the gsn gene during stress is highly regulated and orchestrated by a supramolecular protein complex involved in both transcriptional and epigenetic control of expression. Considering that the repression of gene expression mediated by H3K27me3 is still largely unknown in fungi, and that NPF was initially described to be related to thermal stress, we took advantage of the relatively simple N. crassa system to explore the possible involvement of NPF in the fungus's adaptive response to heat-shock stress. To this, we analyzed the behavior of a N. crassa npf gene mutant strain (Δnpf) subjected to heat stress (45°C), using the complemented mutant strain as a control and the wild-type strain of the fungus as the background. Additionally, the Δnpf strain was characterized morphologically. Our results demonstrated that the Δnfp strain exhibits a defective phenotype during vegetative growth (30°C), such as reduced conidiation, low production of carotenoids, mycelium with highly branched, reduced volume hyphae, irregular edges, shortened extensions, and a delayed basal hyphal extension rate. When subjected to increased temperature, the Δnpf strain showed drastically reduced radial growth. Furthermore, fluorescence microscopy assays using the complemented strain showed that NPF moves toward the nucleus during thermal shock, supporting results published by our group and suggesting a possible role for this protein in modulating gene expression under stress conditions. Although preliminary, our results are important, as they assign a relevant role to NPF in the vegetative development of the fungus and its adaptation to heat stress, contributing to a better understanding of the molecular mechanisms involved in fungal adaptation to adverse environmental conditions.
Preliminary studies on the functional and biochemical characterization of the NPF protein, the product of ORF NCU06679 from Neurospora crassa
Keywords: Neurospora crassa; Expressão gênica; Heterocromatina; Proteínas de choque térmico; Estresse térmico