Maturação oocitária in vitro baseada em referências fisiológicas: efeitos sobre a produção embrionária em bovinos - Dellaqua, Thaisy Tino [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
A maturação in vitro (MIV) de oócitos é um desafio na produção de embriões, devido à desregulação entre a maturação nuclear e citoplasmática causada pelos protocolos vigentes. Modelos de MIV bifásica, que simulam condições fisiológicas, são empregados para melhorar a comunicação cumulus-oócito e competência oocitária. Este estudo investigou os efeitos de uma nova abordagem bifásica, com indução sequencial de FSH e AREG durante a MIV de oócitos bovinos, sobre a progressão meiótica, perfil proteico das células do cumulus (CCs) e o desenvolvimento embrionário inicial in vitro. Complexos cumulus-oócito (COCs) foram aspirados de ovários de abatedouro e maturados in vitro sob duas abordagens: contínua (controle, com FSH e AREG) e sequencial (SEQ, com FSH seguido por FSH+AREG). A progressão meiótica foi determinada pela proporção de oócitos que atingiram a quebra da vesícula germinativa (GVBD), metáfase I (MI) e II (MII) às 6, 9 e 22 h de MIV, respectivamente. As CCs foram desnudas dos oócitos e analisadas pela abordagem proteômica shotgun. A expansão do cumulus foi avaliada após 24 h de MIV e os COCs foram destinados à fertilização e cultivo in vitro. A produção embrionária foi determinada pelas taxas de clivagem, formação de blastocistos e número total de células embrionárias (CEUA, nº 0021/2022). Diferenças na progressão meiótica, expansão do cumulus, produção de blastocisto e número total de células foram analisadas pelo teste T (P < 0,05). Na proteômica das CCs, as proteínas diferencialmente abundantes foram identificadas por análises multivariadas (PCA) e univariada (teste T ajustado por false discovery rate), e utilizadas na análise de enriquecimento de vias, de acordo com a função molecular. A separação dos grupos foi confirmada pela PCA e evidenciada pelo heatmap. Às 6 h de MIV, 58% dos oócitos no grupo controle e 33,9% no grupo SEQ atingiram a GVBD (P=0,0037). Às 9 e 22 h, proporções semelhantes de oócitos atingiram a MI e MII, respectivamente, sem diferenças na expansão do cumulus, clivagem, produção de blastocistos ou número total de células embrionárias. A proteômica das CCs identificou 835 proteínas. Em resposta à abordagem SEQ, às 6 h, 22 proteínas foram diferentemente abundantes, das quais nove estavam associadas a melhorias na produção de energia, sinalização celular e controle proteolítico. Às 9 h, 32 mostraram alterações significativas, sendo 13 associadas a efeitos adversos no metabolismo energético, desequilíbrio redox e disfunções celulares. Já às 22 h, 40 proteínas diferentemente abundantes foram identificadas, das quais duas estavam associadas à regulação positiva da atividade proteassomal. Os dados demonstram que a abordagem sequencial atrasou a progressão meiótica inicial e alterou o proteoma das CCs, sugerindo melhorias no metabolismo energético e comunicação cumulus-oócito após 6 h de MIV. Apesar dos comprometimentos em 9 h, o sistema SEQ parece restaurar as funções celulares ao aumentar a atividade proteassomal no final da MIV, destacando seu potencial para otimizar a maturação oocitária. Este estudo fornece uma base para investigações futuras sobre MIV com indução sequencial, visando ajustes para prolongar a comunicação cumulus-oócito e melhorar os desfechos da produção embrionária.

In vitro maturation (IVM) of oocytes is a challenge in embryo production due to the dysregulation between nuclear and cytoplasmic maturation induced by conventional protocols. Biphasic IVM models, which more closely mimic physiological conditions, have been employed to enhance maturation and fertilization outcomes. This study aimed to evaluate the effects of a novel biphasic approach, involving sequential induction of FSH and AREG during IVM of bovine oocytes, on meiotic progression, the cumulus cells (CCs) proteome, and early embryo development in vitro. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were aspirated from slaughterhouse ovaries and matured in vitro under two approaches: continuous (control, with FSH and AREG) and sequential (SEQ, with FSH followed by FSH+AREG). Meiotic progression was assessed based on the proportion of oocytes reaching germinal vesicle breakdown (GVBD), metaphase I (MI), and metaphase II (MII) at 6, 9, and 22 h of IVM, respectively. Following maturation, CCs were denuded and subjected to shotgun proteomic analysis. Cumulus expansion was measured after 24 h of IVM, and COCs were subsequently used for in vitro fertilization and embryo culture. Embryo production was evaluated based on cleavage rates, blastocyst formation, and embryo total cell number (CEUA, no. 0021/2022). Differences in meiotic progression, cumulus expansion, blastocyst production, embryo total cell number were assessed using t-tests (P < 0.05). For the CCs proteomics, differentially abundant proteins were identified through multivariate (principal component analysis, PCA) and univariate (false discovery rate-adjusted t-test, P < 0.05) analysis, followed by pathway enrichment analysis based on molecular function. Group separation at each time point was validated by PCA and visualized in a heatmap. At 6 h of IVM, 58% of oocytes in the control group and 33.9% in the SEQ group reached GVBD (P = 0.0037). At 9 and 22 h, similar proportions of oocytes attained MI and MII, respectively, with no significant differences observed in cumulus expansion, cleavage rates, blastocyst formation, or embryo total cell number. The CCs proteomics identified 835 proteins in total. In response to the SEQ approach, at 6 h, 22 proteins were differentially abundant, nine of which were linked to improvements in energy production, cell signaling, and proteolytic regulation. At 9 h, 32 proteins exhibited significant abundance changes, with 13 associated with adverse effects on energy metabolism, redox imbalance, and cellular dysfunction. At 22 h, 40 differentially abundant proteins were identified, with two associated with the upregulation of proteasomal activity. These findings suggest that the biphasic IVM approach delayed early meiotic progression and altered the CC proteome, suggesting improvements in energy metabolism and cumulus-oocyte communication after 6 h of IVM. Despite impairments at 9 h, the SEQ system appears to restore cellular functions by enhancing proteasomal activity at the end of maturation, highlighting its potential to optimize oocyte maturation. This study provides a foundation for future investigations into sequential IVM, aiming to adjust the protocol to prolong cumulus-oocyte communication and improve embryo production outcomes.
In vitro oocyte maturation based on physiological references: effects on embryo production in cattle
Keywords: MIV Bifásica; Proteoma; AREG; Vesícula germinativa; Biphasic IVM; Proteome; Germinal vesicle