Caracterização morfológica, bioquímica, molecular e fenotípica de isolados de BARTONELLA spp. de Roedores e marsupiais no pantanal brasileiro, com descrição de BARTONELLA MARCHADOAE sp. nov e BARTONELLA HARRUSI sp. nov. - Amaral, Renan Bressianini do [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
O gênero Bartonella compreende alphaproteobactérias Gram-negativas intracelulares facultativas e fastidiosas capazes de infectar uma grande variedade de mamíferos e transmitidas por artrópodes vetores. Embora roedores representem importantes reservatórios de Bartonella ao redor do mundo, poucos são os estudos acerca da caracterização genômica de espécies de Bartonella comumente encontradas neste táxon. Por outro lado, Bartonella spp. foi detectada em marsupiais e/ou ectoparasitas associados somente na Austrália e Estados Unidos. O presente estudo teve como objetivo caracterizar molecular, morfológica, bioquímica e fenotipicamente espécies de Bartonella isoladas de amostras de sangue de roedores e marsupiais de vida livre amostrados no Pantanal brasileiro, a maior área úmida da América do Sul. Para tanto, foram capturados 61 animais (59 roedores e 2 marsupiais) em dezembro de 2018 e 76 (70 roedores e 6 marsupiais) em fevereiro de 2019, totalizando 137 pequenos mamíferos amostrados, dos quais 129 (94,4 %) roedores e oito (5,6%) marsupiais. Dentre os 129 roedores amostrados, 79 (61,2%) animais pertenciam à espécie Thrichomys fosteri, quatro (3,1%) à espécie Clyomys laticeps, e 46 (35,7%) à espécie Oecomys mamorae. Dentre os oito marsupiais capturados, 5 (62,5%) pertenciam à espécie Thylamys macrurus e 3 (37,5%) à espécie Monodelphis domestica. Todas as amostras biológicas foram submetidas à qPCR para Bartonella spp. baseada no gene nuoG, cultura líquida de pré-enriquecimento e cultura sólida em ágar chocolate. Bartonella spp. foi detectada em 24% dos roedores amostrados e em quatro dos oito marsupiais amostrados. Uma cepa isolada de amostra de sangue de T. fosteri e uma cepa isolada de amostra de sangue de T. macrurus que se mostraram intimamente relacionadas ao complexo Bartonella vinsonii por meio de análises filogenéticas (Máxima Verossimilhança) e de distância (SplitsTree) baseadas em diversos marcadores moleculares, foram selecionadas para sequenciamento do genoma completo, utilizando para tal abordagem híbrida em plataformas de sequenciamento Illumina NovaSeq e Nanopore. As cepas isoladas de T. fosteri (strain 56A) e T. macrurus (117A) exibiram um genoma circular de 2,7 Mbp e 2,35 Mbp, com um conteúdo C + G médio de 39% e 38,8%, e codificação de 2.239 e 2.013 genes, respectivamente. Além disso, exibiram uma identidade nucleotídica média (ANI) de 85% com espécies de Bartonella do grupo vinsonii e de 91% entre si. Análise filogenômica baseada em 291 genes codificantes para proteínas e compartilhados entre genomas de 53 espécies de Bartonella, posicionou ambas as cepas em um clado intimamente relacionado a Bartonella vinsonii subsp. vinsonii, B. vinsonii subsp. berkhoffii e B. vinsonii subsp. arupensis, com alto valor de suporte de clado, apoiando a separação destas cepas em duas espécies diferentes, agora formalmente denominadas Bartonella machadoae nov. sp. (isolada de T. fosteri) e Bartonella harrusi nov. sp. (isolada de T. macrurus). Bartonella machadoae sp. nov. e Bartonella harrusi sp. nov. foram caracterizadas como pequenos bastonetes capnofílicos, microaerofílicos e aeróbios com ausência de pili e flagelos. Em conclusão, descrevemos as características bioquímicas, morfológicas, fenotípicas e genômicas de Bartonella machadoae, uma nova espécie isolada de amostras de sangue de roedor da espécie T. fosteri, e de Bartonella harrusi, uma nova espécie isolada de amostras de sangue de marsupiais da espécie T. macrurus, no Pantanal brasileiro.

The genus Bartonella comprises facultative and fastidious intracellular Gramnegative alphaproteobacteria capable of infecting a wide variety of mammals and transmitted by arthropod vectors. Although rodents represent important reservoirs of Bartonella around the world, there are few studies on the genomic characterization of Bartonella species commonly found in this taxon. On the other hand, Bartonella spp. has been detected in marsupials and/or associated ectoparasites only in Australia and the United States. The present study aimed to characterize molecularly, morphologically, biochemically, and phenotypically Bartonella isolated from blood samples of free-living rodents and marsupials sampled in the Brazilian Pantanal, the largest wetland in South America. For this purpose, 61 animals (59 rodents and 2 marsupials) were captured in December 2018 and 76 (70 rodents and 6 marsupials) in February 2019, totaling 137 small mammals sampled, of which 129 (94.4%) were rodents and eight were (5.6%) marsupials. Among 129 rodents sampled animals, 79 (61.2%) were Thrichomys fosteri, four (3.1%) Clyomys laticeps, 46 (35.7%) were Oecomys mamorae. Among the eight marsupials, 5 (62,5%) were Thylamys macrurus and 3 (37,5%) were Monodelphis domestica. Biological samples were submitted to a qPCR for Bartonella based on the nuoG gene, pre-enrichment liquid culture and solid culture on chocolate agar. Bartonella spp. detected in 24% of sampled rodents and in 4 out of 8 sampled marsupials. A strain isolated from a blood sample of T. fosteri and a strain isolated from a blood sample of T. macrurus, which shown to be closely related to the Bartonella vinsonii complex by phylogenetic (Maximum Likelihood) and distance (SplitsTree) analyzes based on several molecular markers, were selected for whole genome sequencing, using for such a hybrid approach in Illumina NovaSeq and Nanopore sequencing platforms. The isolated strains of T. fosteri (strain 56A) and T. macrurus (117A) exhibited a circular genome of 2.7 Mbp and 2.35 Mbp, with an average C + G content of 39% and 38.8%, and encoding 2.239 and 2.013 genes, respectively. In addition, they exhibited a mean nucleotide identity (ANI) of 85% with Bartonella species of the vinsonii group and 91% with each other. Phylogenomic analysis based on 291 protein-coding genes shared between genomes of 53 Bartonella species positioned both strains in a clade closely related to Bartonella vinsonii subsp. vinsonii, B. vinsonii subsp. berkhoffii and B. vinsonii subsp. arupensis, with high clade support value, supporting the separation of these new strains into two different species, now formally named Bartonella machadoae nov. sp. (isolated from T. fosteri) and Bartonella harrusi nov. sp. (isolated from T. macrurus). Bartonella machadoae sp. nov. and Bartonella harrusi sp. nov. were characterized as small capnophilic, microaerophilic and aerobic rods with the absence of pili and flagella. In conclusion, we describe the biochemical, morphological, phenotypic and genomic characteristics of Bartonella machadoae, a new species isolated from T. fosteri rodent blood samples, and Bartonella harrusi, a new species isolated from T. macrurus marsupial blood samples in the Brazilian Pantanal.
Morphological, biochemical, molecular and phenotypic characterization of BARTONELLA spp. of Rodents and marsupials in the Brazilian Pantanal, with description of BARTONELLA MARCHADOAE sp. nov and BARTONELLA HARRUSI sp. nov.
Keywords: Marsupialia; Rodentia; Filogenômica; Bioquimica