Prevenção da osteonecrose dos maxilares induzida por medicamentos com a utilização da terapia fotodinâmica, biomaterial e doxiciclina: estudo experimental in vitro e in vivo - Hadad, Henrique [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
Os bifosfonatos (BF’s) são medicamentos antirreabsortivos empregados no tratamento de desordens esqueléticas, como a osteoporose, porém seu uso prolongado pode induzir a osteonecrose dos maxilares induzida por medicamentos (OMIM), e o tratamento desta condição representa um desafio para odontologia. Esse projeto foi dividido em 4 capítulos, de modo que no Capítulo 1, o objetivo do trabalho foi avaliar os resultados de vários modelos animais de roedores para estudar a OMIM. Após uma busca na literatura, seguindo a estratégia PICO estabelecida 2004 artigos foram localizados e 118 corroboraram com os fatores de inclusão (estudo in vivo em roedores avaliando a extração dentária como um fator de risco para o desenvolvimento da OMIM. Os resultados demonstram diversos estudos que estabeleceram protocolo para indução da OMIM. O ácido zoledrônico (ZA) foi o medicamento mais utilizado, seguido pelo alendronato (ALN). Mesmo quando o ZA não levou ao desenvolvimento de MRONJ, seu efeito comprometeu a homeostase do osso e do tecido mole. A associação de outros fatores de risco (dexametasona, diabetes e doenças inflamatórias locais), além da extração dentária também desempenharam um papel importante no desenvolvimento da OMIM. Além disso, os estudos demonstraram uma relação entre a dose e o desfecho e entre a frequência e a via de administração. Desse modo, conclui-se que o ZA pode causar OMIM em roedores, e que procedimentos cirúrgicos e doenças inflamatórias locais na cavidade oral são elementos-chave no desenvolvimento da OMIM; No Capítulo 2, o objetivo foi avaliar os efeitos de diferentes concentrações de ácido zoledrônico (ZA) durante a diferenciação osteogênica de células-tronco da medula óssea humana (hBMSCs). Para tal, a diferenciação osteogênica das hBMSCs foi conduzida com diferentes concentrações de ZA (0, 0,1, 1,0 e 5,0 μM) durante os primeiros 3 dias. O metabolismo celular foi quantificado em 1, 3, 7 e 14 dias. Aos 7 e 14 dias, foram realizadas as seguintes análises: a) ensaio de nódulo de mineralização, b) LIVE/DEAD™, c) adesão e espalhamento celular, d) atividade da fosfatase alcalina (ALP) e e) análise qPCR para RUNX-2), ALPL e COL1 A1. Os dados foram analisados por ANOVA de 2 vias, seguido pelo teste post hoc de Tukey (p < 0,05). O metabolismo celular (3, 7 e 14 dias) (p < 0,001), a mineralização (7 e 14 dias) (p < 0,001) e a atividade de ALP (14 dias) (p < 0,001) foram reduzidos em ZA 5,0 µM quando comparados ao controle (sem ZA). Além disso, a ZA 5,0 µM reduziu a expressão de RUNX2 aos 7 e 14 dias (p < 0,001). Desse modo, concluiu-se que a ZA (5,0 µM) pode prejudicar a diferenciação de hBMSC em osteoblastos e interferir em sua fase de mineralização; No Capítulo 3, o objetivo foi avaliar as terapias preventivas para OMIM. Após quatro ciclos de administração de ácido zoledrônico (35µg/kg a cada 15 dias), os ratos Wistar tiveram seus molares extraídos e foram organizados em nove grupos de tratamento: grupo de controle negativo (NCG), tratado com solução salina e coágulo sanguíneo no alvéolo; grupo de controle positivo (PCG), com coágulo sanguíneo no alvéolo; BG, biomaterial à base de β-fosfato tricálcico; DG, gel de doxiciclina a 10%; aG, terapia fotodinâmica antimicrobiana; e DBG, aBG, aDG e aDBG, usando terapia combinada. Após 28 dias, o menor volume ósseo (BV/TV) foi registrado em PCG (42,17% ± 2,65) e o maior em aDBG (69,85% ± 6,25) (p < 0,05). Os valores mais altos da taxa de aposição mineral diária foram registrados no aDBG (2,64 ± 0,48) e no DBG (2,30 ± 0,37) (p < 0,001). Além disso, o aDBG apresentou a maior área de osso neoformado (82,44% ± 2,69) (p < 0,05). O osso não vital foi relatado apenas no GPC (37,94 ± 18,70%). Devido ao papel fundamental do biomaterial, a abordagem combinada (aDBG) foi a mais eficaz na prevenção de MRONJ após a extração dentária; No Capítulo 4, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito tópico da doxiciclina gel (10%) na prevenção da OMIM. Para isso, ratos Wistar (72) foram tratados com 70 µg de ZA/mês por 2 meses e, em seguida, foi realizada a extração do primeiro molar, um grupo recebeu apenas um coágulo no alvéolo (grupo ZA), outro recebeu um gel de doxiciclina a 10% (DOXI), enquanto o grupo controle foi tratado sistemicamente com solução salina (SAL). Após 7, 14 e 28 dias, as amostras foram submetidas a a) análise histomorfométrica, b) imunohistoquímica e c) maturação das fibras de colágeno. Os dados demonstraram que a DOXI apresentou maior área de osso novo quando comparada à ZA em 7 (p = 0,0058), 14 e 28 dias (p < 0,0001), e a quantidade de osso não vital na ZA (44,17± 10,93%) foi estatisticamente significativa somente aos 28 dias (p < 0,0001) quando comparada à SAL e à DOXI. A marcação TRAP foi semelhante para ZA e DOXI, exceto aos 28 dias, quando ZA apresentou marcação leve, enquanto DOXI apresentou marcação moderada. Além disso, a marcação de OCN foi semelhante entre os grupos ZA e DOXI, porém, aos 7 dias, o DOXI apresentou marcação moderada, enquanto o ZA apresentou marcação leve. O grupo DOXI apresentou uma quantidade maior de fibras de coloração amarelo-esverdeada nos dias 14 e 28 (p = 0,0001 e p < 0,0001, respectivamente), quando comparado ao grupo ZA. Eles também apresentaram maior maturação das fibras de colágeno (cor vermelho-amarelada) nos dias 14 e 28 (p = 0,0027 e p < 0,0001, respectivamente). Desse modo, concluiu-se que a doxiciclina parece ser um agente eficaz e seguro na prevenção da OMIM.

Bisphosphonates (BP’s) are anti-resorptive drugs used in the treatment of skeletal disorders, such as osteoporosis, but their prolonged use may induce osteonecrosis of the jaw (MRONJ), which represents a challenging treatment for dentistry. This thesis were divied in 4 chapters, in this way, Chapter 1 aimed to assess the outcomes of several rodent animal models for studying medication-related osteonecrosis of the jaw (MRONJ). After a search of the databases, 2004 articles were located, and 118 corroborated the inclusion factors (in vivo studies in rodents evaluating tooth extraction as a risk factor for the development of MRONJ). Numerous studies attempting to establish an optimal protocol to induce MRONJ were found. Zoledronic acid (ZA) was the most used drug, followed by alendronate (ALN). Even when the ZA did not lead to the development of MRONJ, its effect compromised the homeostasis of the bone and soft tissue. The association of other risk factors (dexamethasone, diabetes, and inflammatory dental disease) besides tooth extraction also played a role in the development of MRONJ. In addition, studies demonstrated a relationship between dose and outcome and between frequency and administration route for MRONJ. Thus, it was concluded that ZA may cause MRONJ in rodents. Surgical procedures and inflammatory dental disease in the oral cavity are key elements in starting MRONJ; Chapter 2 aimed to evaluate the effects of different concentrations of ZA during the osteogenic differentiation of human Bone Marrow Stem Cells (hBMSCs). Thus, osteogenic differentiation of hBMSCs were conducted with different concentrations of ZA (0, 0.1, 1.0, and 5.0μM) for the first 3-days. Cell metabolism was quantified at 1-, 3-, 7-, and 14 days. At 7- and 14-days, the following analyses were performed: a) mineralization nodule assay, b) LIVE/DEAD™, c) cell adhesion and spreading, d) alkaline phosphatase (ALP) activity, and e) qPCR analysis for RUNX-2), ALPL, and COL1 A1. Data were analyzed by ANOVA 2-way, followed by Tukey’s post hoc test (p < 0.05). Results demonstrated that cell metabolism (3-, 7-, and 14-days) (p < 0.001), mineralization (7-, 14-days) (p < 0.001), and ALP activity (14-days) (p < 0.001) were reduced in ZA 5.0 μM when compared to control (no ZA). Also, ZA 5.0 μM downregulated the expression of RUNX2 at 7- and 14-days (p < 0.001). It is possible to conclude that ZA (5.0 μM) can impair hBMSC differentiation into osteoblasts and interferes with its mineralization phase; Chapter 3 aimed to evaluate the preventive therapies for MRONJ. Following four cycles of zoledronic acid administration, Wistar rats had their molar extracted, and were organized into nine treatment groups: negative control group (NCG), treated with saline solution and blood-clot in the alveolus; positive control group (PCG), with blood-clot in the alveolus; BG, β-tricalcium phosphate-based biomaterial; DG, 10% doxycycline gel; aG, antimicrobial photodynamic therapy; and DBG, aBG, aDG, and aDBG, using combination therapy. After 28 days, the lowest bone volume (BV/TV) was reported in PCG (42.17% ± 2.65), and the highest in aDBG (69.85% ± 6.25) (p < 0.05). The higher values of daily mineral apposition rate were recorded in aDBG (2.64 ± 0.48) and DBG (2.30 ± 0.37) (p < 0.001). Moreover, aDBG presented with the highest neoformed bone area (82.44% ± 2.69) (p < 0.05). Non-vital bone was reported only in the PCG (37.94 ± 18.70%). Owing to the key role of the biomaterial, the combination approach (aDBG) was the most effective in preventing MRONJ following tooth extraction; and Chapter 4 aimed to assess the topical effect of doxycycline gel (10%) during bone repair in vivo on the osteonecrosis model. For this purpose, Wistar rats (72) were treated with 70 μg of ZA/month for 2 months, then extraction of the first molar was performed, one group received only a clot in the socket (ZA group), one received a 10% doxycycline gel (DOXI), while the control group was treated systemically with saline solution (SAL). After 7, 14, and 28 days, samples were submitted for a) histomorphometric analysis, b) immunohistochemical, and c) collagen fibers maturation. Data demonstrated that DOXI presented higher new bone area when compared to ZA in 7 (p = 0.0058), 14, and 28 days (p < 0.0001), and the amount of non-vital bone in ZA (44.17± 10.93%) was statistically significant only at 28 days (p < 0.0001) when compared to SAL and DOXI. TRAP labelling was similar for ZA and DOXI, except for 28-day when ZA presented mild labelling, while DOXI showed moderate labelling. Also, OCN labelling was similar between the ZA and DOXI groups, however at 7 days DOXI showed moderate labelling, while ZA showed mild labelling. DOXI group presented a higher amount of collagen type 3 (greenish-yellow coloured) fibers on days 14 and 28 (p = 0.0001 and p < 0.0001, respectively), when compared to ZA. They also showed greater maturation of collagen fibers – type 1 (yellowish-red colour) on days 14 and 28 (p = 0.0027 and p < 0.0001, respectively). Conclusion: doxycycline seems to be an effective agent in the prevention of osteonecrosis.
Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), biomaterial, and doxycycline to prevent medication-related osteonecrosis of the jaw. Experimental in vitro and in vivo study
Keywords: Osteonecrose; Fotoquimioterapia; Doxiciclina; Alvéolo dental; Materiais biomedicos; Osteonecrosis