Desenvolvimento de um inoculante de bactérias diazotróficas a base de resíduos agroindustriais para a promoção de crescimento da cana-de-açúcar - Oliveira, Fernando Augusto Araujo Donangelo [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
A indústria de fertilizantes de nitrogênio requer muita energia via dependência de combustíveis fósseis, com riscos de contaminação de solos e águas com nitratos levando à riscos ambientais severos, além de encarecimento dos alimentos. Alternativamente, o nitrogênio atmosférico pode ser assimilado por bactérias diazotróficas e para diminuir a utilização de fertilizantes nitrogenados é necessário entender melhor a capacidade dessas bactérias se associarem à cana desde o início do cultivo da mesma. Assim, este estudo objetivou desenvolver um bioprocesso de produção de bactérias fixadoras de nitrogênio, utilizando meios de baixo custo, que possa favorecer o crescimento de plântulas de cana-de-açúcar micropropagadas in vitro. As bactérias Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia tropica, Pseudomonas stutzeri, Herbaspirillum seropedicae, Azospirillum brasilense e um isolado desconhecido foram avaliadas quanto ao crescimento em meios formulados alternativos. Para tanto foi realizada a análise da turbidez do cultivo em diferentes concentrações de água de maceração de milho (AMM) e sais, além de diferentes pHs (6 a 7,6) e temperaturas (25 a 35ºC). Posteriormente, também foi avaliada a inserção de um extrato de levedura residual fornecido pela Yes (ELY) na composição desse meio. A avaliação da fixação de N2 foi feita no cultivo de maior crescimento bacteriano, através do método de Kjeldahl. A micropropagação de meristema apical de cana-de-açúcar in vitro foi realizada para obtenção de plântulas. Estas foram então cultivadas em meio MS (controle) ou MS/10 (com 1/10 dos constituintes do meio original), com diferentes combinações de bactérias diazotróficas. Avaliação do crescimento das plântulas foi feita através da diferença de massa vegetal do início e final do cultivo (14 dias). Foi possível obter um meio econômico com resíduo agroindustrial para cultivo das bactérias com apenas 2,5 % AMM e 0,2 % KH2PO4. As melhores condições para as seis bactérias nesse meio de cultura foram pH 6,0 e 30°C. A sétima bactéria (isolada da região), ainda não identificada, foi capaz de crescer em meio com 1,25% AMM e 0,75% ELY. As seis bactérias apresentaram crescimento de 5,32 x 108 cel/mL (H. rubrisubalbicans) até 1,24 x 109 cel/mL (P. stutzeri). Dos 63 tratamentos de inoculante no meio MS/10 para cultivo da cana-de-açúcar, o tratamento com o H. rubrisubalbicans (T59) propiciou ganho de massa vegetal igual ao controle. Além disso, outros 34 tratamentos apresentaram não significância estatística pelo teste de Dunnett (α = 0,05). No entanto, em todos os tratamentos foi possível observar a formação de uma película no entorno da raiz, evidenciando a fixação biológica de nitrogênio e uma potencial associação com o tecido vegetal. Ainda, a análise da concentração de nitrogênio presente tanto no meio de cultura quanto nas plântulas evidenciou um ganho substancial em relação ao controle, principalmente no meio.

The nitrogen fertilizers industry requires a lot of energy through fossil fuels dependence, with risks of soil and water contamination with nitrates leading to severe environmental risks besides the food price increase. Alternatively, the atmospheric nitrogen can be assimilated by diazotrophic bacteria and to reduce the nitrogen fertilizer it is necessary to better understand the ability of these bacteria to associate with sugarcane since the beginning of the cultivation. Thereby this study aimed to develop a bioprocess to produce nitrogen-fixing bacteria, using low-cost culture medium which may promote the micropropagated sugarcane growth in vitro. The bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia tropica, Pseudomonas stutzeri, Herbaspirillum seropedicae, Azospirillum brasilense and an unknown isolate were evaluated for growth in alternative formulated culture medium. For that, turbidity analysis of the culture was carried out in different corn steep water (CSW) and salts concentrations and also different pH (6 to 7.6) and temperatures (25 to 35°C). Later, a residual yeast extract provided from Yes (YEY) was evaluated in the composition of the culture medium. The assessment of N2 fixation was performed in the highest bacterial growth culture through Kjeldahl’s method. The sugarcane apical meristem micropropagation was accomplished to obtain plantlets for the cultivation in MS medium (control) or MS/10 (containing one tenth of the original medium) inoculated with different combinations of diazotrophic bacteria. The plantlet growth evaluation was carried out using the difference between the weight of the start and end of cultivation (14 days). It was possible to obtain an economic medium with agro-industrial residue for the culture of the bacteria with only 2.5% CSW and 0.2% KH2PO4 and the best conditions for the six bacteria in this culture medium was pH 6.0 and 30°C. The seventh bacterium (unknown isolate from the region) was able to grow with 1.25% CSW and 0.75% YEY. The six bacteria showed growth from 5.32 x 108 cells/mL (H. rubrisubalbicans) to 1.24 x 109 cells/mL (P. stutzeri). Of the 63 inoculant treatments in the MS/10 medium for the sugarcane cultivation, the H. rubrisubalbicans treatment (T59) provided a gain in plant mass equal to the control. In addition, another 34 treatments were not statistically significant by the Dunnett’s test (α = 0,05). Nevertheless, it was possible to observe a pellicle formation in the rhizosphere of all treatments, demonstrating the biological nitrogen fixation and a potential association of the bacteria with the plant tissue. Furthermore, the nitrogen content analysis both in the culture medium and the plantlet proved a substantial gain when comparing to the control, mainly in the culture medium.
Development of a diazotrophic bacteria inoculant based on agro-industrial residue for sugarcane growth promotion
Keywords: bactérias diazotróficas; cana-de-açúcar; micropropagação vegetal