Pimelodus maculatus: rastreamento de células germinativas primordiais e coleta de sêmen - Evangelista, Mariana Machado [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
Nos últimos anos, Pimelodus maculatus vem sendo utilizado como espécie modelo para o desenvolvimento de técnicas de biotecnologia em Siluriformes. Neste estudo foram abordados aspectos da micromanipulação de embriões e obtenção de espermatozoides de P. maculatus. Assim, o objetivo do artigo 1 foi identificar e rastrear a rota migratória das Células Germinativa Primordiais (PGCs) em P. maculatus. Inicialmente, foram testadas soluções para incubação de embriões decorionados, e a solução de Characin apresentou resultados satisfatórios. Para identificar as PGCs, os embriões decorionados foram microinjetados com mRNA 3'UTR GFP-nos1, e o desenvolvimento foi monitorado em estereomicroscópio de fluorescência. Inicialmente, as PGCs foram visualizadas no estágio 6-10 somitos na região medial do embrião. Posteriormente, as PGCs migraram gradativamente na direção anteroposterior e, no estágio 20-24 somitos, localizaram-se próximo à extremidade posterior da região de extensão do vitelo. Nas larvas recém-eclodidas, as PGCs foram encontradas nas cristas genitais. No artigo 2, foi estabelecida uma metodologia não letal para obtenção de espermatozoides de P. maculatus, e também descritos aspectos da morfologia dos espermatozoides e da histologia dos testículos. No experimento 1, avaliamos os parâmetros espermáticos de amostras obtidas de peixes submetidos a diferentes protocolos de indução: 1) Solução Fisiológica Salina (controle), 2) Extrato Bruto de Hipófise de Carpa (CCPE) 10 mg kg-1 e 3) CCPE 10 mg kg-1 + ocitocina 5 UI kg-1. O protocolo que apresentou melhores resultados foi a indução com CCPE 10 mg kg-1, e no experimento 2 foi comparado ao procedimento de indução hormonal seguido de maceração dos testículos. Neste experimento, não houve diferença entre esses procedimentos quanto aos parâmetros avaliados, o que indicou que a indução com 10 mg kg-1 de CCPE pode ser satisfatoriamente utilizada para a obtenção do sêmen de P. maculatus sem a necessidade de sacrificar os machos para remoção dos testículos. Com relação à morfologia, P. maculatus exibiu espermatozóides do tipo aquasperms, com características típicas de espécies com fertilização externa. A análise histológica dos testículos revelou diferenças entre as regiões anterior e posterior, onde a primeira mostrou atividade espermatogênica, enquanto a segunda apresentou atividade secretora.

In the last few years, Pimelodus maculatus has been used as a model species for the development of biotecnology techniques in Siluriformes. In this study were covered aspects of embryo micromanipulation and obtainment of sperm cells of P. maculatus. Thus, the aim of article 1 was to identify and trace the migratory route of Primordial Germ Cells (PGCs) in P. maculatus. Initialy, it was made a screening of solutions for incubation of dechorionated embryos, and Characin solution showed satisfactory results. To identify the PGCs, dechorionated embryos were microinjected with GFP-nos1 3'UTR mRNA, and development was monitored in fluorescence stereomicroscope. Initially, PGCs were visualized at 6-10 somites stage in the medial region of the embryo. Later, PGCs migrated gradually in anteroposterior direction, and in the 20-24 somites stage, were located near the posterior extremity of the yolk extension region. In newly hatched larvae, PGCs were found in the genital ridges. In article 2, we have established a non-lethal methodology to obtain sperm cells from P. maculatus, and have also described aspects of spermatozoa morphology and histology of testes. In experiment 1, we assessed the sperm parameters of samples obtained from fish submitted to different induction protocols: 1) Physiological Saline (control), 2) Crude Carp Pituitary Extract (CCPE) 10 mg kg-1 and 3) CCPE 10 mg kg-1 + Oxytocin 5 UI kg-1. The protocol that showed the best results was induction with CCPE 10 mg kg-1, and in experiment 2 it was compared to the procedure of hormonal induction followed by testes maceration. In this experiment, there was no difference between such procedures concerning the parameters evaluated, which indicated that induction with CCPE 10 mg kg-1 may be satisfactorily used to obtain semen from P. maculatus without having to kill the fish for testes removal. With regard to its morphology, P. maculatus exhibited aquasperm spermatozoa, with some typical characteristics of species with external fertilization. Histological analysis of the testes revealed differences between the anterior and posterior regions, where the former showed spermatogenic activity, while the latter showed secretory activity.
Pimelodus maculatus: primordial germ cells traceability and semen collection
Keywords: Micromanipulação; Reprodução induzida; Banco genético