Sexagem e acondicionamento de embriões equinos pré-implantacionais produzidos in vivo - Camargo, Giovana Siqueira [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
A sexagem de embriões equinos através do fluido da blastocele (FB), é uma biotecnologia recente, e associada ao transporte de embriões têm boas perspectivas no campo. Objetivos:(1) testar a técnica de sexagem por PCR do FB de embriões pré-implantacionais produzidos in vivo coletado a partir do colapso embrionário com agulha hipodérmica; (2) avaliar a capacidade de re-expansão embrionária após acondicionamento destes embriões produzidos in vivo colapsados; (3) avaliar a qualidade e tamanho de embriões produzidos in vivo, colapsados e íntegros, após simulação de transporte sob acondicionamentos em temperatura ambiente (25ºC) e refrigeração à 5ºC por 24 horas. As condições experimentais visaram mimetizar condições aplicáveis à rotina de campo. Métodos: I -Foram coletados 42 embriões e distribuídos aleatoriamente entre quatro grupos experimentais: CTA (n=11 embriões colapsados acondicionados em temperatura ambiente), CTR (n=11 embriões colapsados acondicionados sob refrigeração), NCTA (n=10 embriões não colapsados acondicionados em temperatura ambiente) e NCTR (n=10 embriões não colapsados acondicionados sob refrigeração), e todos armazenados por um período de 24 horas. II -As amostras de FB (n=19) foram coletadas após o colapso dos embriões com agulha hipodérmica 26G, dos grupos CTA e CTR, e foram submetidas as duas PCR sequenciadas com os primers específicos TSPY e AMEL para a identificação dos sexos. III - Apenas três embriões (n=1 CTA, n=1 CTR, e n=1 imediatamente após o colapso) foram submetidos a microscopia por fluorescência com marcador DAPI e microscopia de interferência de contraste (DIC) para uma análise descritiva da lesão. Resultados: (I)Todos os embriões submetidos ao colapso sofreram redução no tamanho após as 24h, mas os acondicionados em temperatura ambiente (25ºC) apresentaram uma melhor qualidade morfológica após as 24h. Dos embriões íntegros, apenas o grupo NCTA obtiveram uma taxa de crescimento positiva (+25,95%) e mantiveram sua qualidade de grau 1 excelente em M24, enquanto que os refrigerados a 5ºC apresentou uma queda na classificação com 20% de embriões degenerados após as 24h. (II) A técnica de sexagem por FB mostrou-se eficiente com o diagnóstico de 57,90% de machos, através da amplificação de bandas especificas para TSPY com as duas PCR sequenciadas. (III) A lesão embrionária causada pelo colapso manual com a agulha hipodérmica 26G foi visualizada por microscopia de fluorescência. É possível realizar a sexagem embriões equinos através de amostras do FB por PCR. Conclusões: Os embriões colapsados com a agulha hipodérmica 26G são capazes de se recuperar parcialmente das lesões, principalmente quando acondicionados em meio de manutenção em temperatura ambiente por até 24h. A temperatura ambiente (25ºC) demonstrou ser a melhor temperatura de acondicionamento para o transporte de embriões equinos íntegros e colapsados por até 24h, dentro das condições apresentadas, por atuar diretamente otimizando a qualidade morfológica durante as 24hrs. Estudos complementares são necessários para comprovar a viabilidade das células embrionárias pós-colapso como teste in vitro, e a aplicabilidade de inovulação desses embriões para obtenção de suas possíveis taxas de prenhez e perdas embrionárias como teste in vivo.

The sexing of equine embryos through the blastocoel fluid (BF) is a recent biotechnology, and associated with embryo transport has good prospects in the field. Objectives:(1) to test the technique of PCR sexing the FB of pre-implantation embryos produced in vivo collected from embryonic collapse with a hypodermic needle; (2) to evaluate the capacity of embryonic re-expansion after packaging these collapsed in vivo produced embryos; (3) to evaluate the quality and size of embryos produced in vivo, collapsed and intact, after simulation of transport under packaging at room temperature (25ºC) and refrigeration at 5ºC for 24 hours. The experimental conditions aimed to mimic conditions applicable to the field routine. Methods: I - Forty-two embryos were collected and randomly distributed among four experimental groups: CTA (n=11 collapsed embryos conditioned at room temperature), CTR (n=11 collapsed embryos conditioned under refrigeration), NCTA (n=10 non-collapsed embryos conditioned at room temperature) and NCTR (n=10 non-collapsed embryos stored under refrigeration), and all stored for a period of 24 hours. II - The FB samples (n=19) were collected after the embryos collapsed with a 26G hypodermic needle, from the CTA and CTR groups, and were submitted to two PCR sequenced with the specific primers TSPY and AMEL to identify the sexes. III - Only three embryos (n=1 CTA, n=1 CTR, and n=1 immediately after collapse) were submitted to fluorescence microscopy with DAPI marker and contrast interference microscopy (DIC) for a descriptive analysis of the lesion. Results: (I) All embryos submitted to collapse suffered a reduction in size after 24h, but those conditioned at room temperature (25ºC) showed a better morphological quality after 24h. Of the intact embryos, only the NCTA group achieved a positive growth rate (+25.95%) and maintained their excellent grade 1 quality in M24, while those refrigerated at 5ºC showed a decrease in classification with 20% of embryos degenerated after at 24h. (II) The FB sexing technique proved to be efficient with the diagnosis of 57.90% of males, through the amplification of specific bands for TSPY with the two sequenced PCRs. (III) The embryonic lesion caused by manual collapse with the 26G hypodermic needle was visualized by fluorescence microscopy. It is possible to sex equine embryos using FB samples by PCR. Conclusions: Embryos collapsed with the 26G hypodermic needle are able to partially recover from the lesions, especially when placed in a maintenance medium at room temperature for up to 24 hours. Room temperature (25ºC) proved to be the best packaging temperature for the transport of intact and collapsed equine embryos for up to 24 hours, under the conditions presented, by acting directly optimizing the morphological quality during the 24 hours. Complementary studies are needed to prove the viability of post-collapse embryonic cells as an in vitro test, and the applicability of inovulation of these embryos to obtain their possible pregnancy and embryo loss rates as an in vivo test.
Sexing and packaging of preimplantational equine embryos produced in vivo
Keywords: PCR; Colapso embrionário; Blastocele; Armazenamento; Transporte; Embryonic collapse; Blastocoel; Storage; Transport