Cascatas multienzimáticas aplicadas na síntese estereosseletiva de beta-hidroxiamidas - Tordato, Éverton Alves [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
A tão almejada meta global de desenvolvimento sustentável pode ser facilitada, no âmbito dos processos químicos, pelo uso de biocatalisadores nas reações de sínteses orgânicas. O uso de sistemas em cascatas multienzimáticas propicia menor geração de resíduos, uma vez que dispensa o isolamento e purificação dos intermediários sintéticos, reduzindo, desta forma, o consumo de produtos químicos (especialmente solventes), energia, espaço e tempo. As β-hidroxiamidas são intermediários sintéticos que podem ser empregados como blocos construtores quirais na síntese de ingredientes farmacêuticos ativos, polímeros, heterociclos, etc. Neste trabalho, foram realizadas triagens com 3 diferentes classes de enzimas para serem utilizadas nas reações em cascata, sendo: 13 nitrila hidratases disponíveis comercialmente, 7 cetorredutases sendo 4 de células íntegras de microrganismos (Bacillus cereus, Lysinibacillus boronitolerans, Saccharomyces cerevisiae e MLH 15) e 3 enzimas isoladas disponíveis comercialmente (Horse Liver, Recombinante e Saccharomyces cerevisiae) e 9 ω-transaminases sendo 5 expressas heterologamente (Aspergillus terreus, Chromobacterium violaceum, Mycobacterium vanbaalenii, Ruegeria pomeroyi e Vibrio fluvialis) e 4 enzimas isoladas comerciais (Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Neosartorya fischeri e Penicillium chrysogenum) com a finalidade de investigar a atividade e estereosseletividade dessas enzimas frente aos compostos de interesse deste projeto. Nas triagens com nitrila hidratases, 4 enzimas apresentaram grande potencial para catalisar a conversão dos substratos benzoilacetonitrila, rac-3-hidroxi-3-fenilpropanonitrila e rac-3-amino-3-fenilpropanonitrila nas amidas correspondentes com conversões que variaram de 86 - >99%. Não foi observada estereosseletividade para as enzimas nitrila hidratases. As conversões e ee dos microrganismos contendo cetorredutases com o substrato benzoilacetonitrila foram de 5 - 26% e 87 - 92%, respectivamente, com formação predominante do enantiômero (S). Porém, a enzima cetorredutase isolada e recombinante apresentou conversão e ee >99 do enantiômero (S). Também foi realizado um ensaio com o microrganismo Bacillus cereus e a cetorredutase recombinante frente ao substrato 3-oxo-3-fenilpropanamida e nenhuma conversão foi observada. Em relação as ω-transaminases expressas heterologamente e as enzimas isoladas nenhuma conversão foi observada frente ao substrato benzoilacetonitrila e 3-oxo-3-fenilpropanamida. Entretanto, como algumas enzimas nitrila hidratases haviam demonstrado grande potencial para a catálise dos três substratos citados acima e uma cetorredutase recombinante também havia apresentado excelente conversão e ee, o composto (S)-3-hidroxi-3-fenilpropanamida pôde ser obtido de duas formas diferentes de reações em cascata a partir da reação de redução/hidratação do substrato benzoilacetonitrila. Na abordagem de reações em cascatas multienzimáticas simultânea a conversão foi de 83% e ee >99% e na abordagem de reações em cascatas multienzimáticas sequencial a conversão foi de >99% e ee >99% em condições ambientalmente amigáveis de reação e eliminando etapas de extração e purificação do intermediário. Portanto, essas metodologias mostraram-se promissoras para o desenvolvimento de um processo sustentável visando a obtenção de compostos versáteis com elevada pureza enantiomérica.

The long-awaited global goal of sustainable development can be facilitated, in the context of chemical processes, by the use of biocatalysts in the organic synthesis reactions. The use of multi-enzymatic cascade systems results in less waste generation, since it eliminates the isolation and purification of synthetic intermediates, reducing the consumption of chemicals (especially solvents), energy, space and time. β-hydroxyamides are synthetic intermediates which can be employed as chiral building blocks in the synthesis of active pharmaceutical ingredients, polymers, heterocycles, etc. In this work, three different classes of enzymes were used for the cascade reactions: 13 nitriles hydratases commercially available, 7 keto reductases being 4 whole cells of microorganisms (Bacillus cereus, Lysinibacillus boronitolerans, Saccharomyces cerevisiae and MLH 15) and 3 isolated commercially available enzymes (Horse Liver, Recombinant and Saccharomyces cerevisiae) and 9 ω-transaminases, being 5 heterologously expressed (Aspergillus terreus, Chromobacterium violaceum, Mycobacterium vanbaalenii, Ruegeria pomeroyi and Vibrio fluvialis) and 4 commercially isolated enzymes (Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Neosartorya fischeri and Penicillium chrysogenum) with the purpose of investigating the activity and stereoselectivity of these enzymes with the substrates of interest of this project. In the screening of nitrile hydratase, 4 enzymes showed great potential to catalyze the conversion of the benzoylacetonitrile, rac-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile and rac-3-amino-3-phenylpropanenitrile substrates into the corresponding amides with conversions ranging from 86 -> 99 %. No stereoselectivity was observed with these enzymes. Conversions and ee of the whole cells biocatalysts containing keto reductases with benzoylacetonitrile were 5 - 26% and 87-92%, respectively, with predominant (S)-enantiomer formation. However, an isolated and recombinant keto reductase enzyme showed conversion and ee >99% of the (S)-enantiomer. An assay was also performed with Bacillus cereus and the recombinant keto reductase with 3-oxo-3-phenylpropanamide substrate and no conversion was observed. In relation to the heterologously expressed ω-transaminases and the isolated enzymes no conversion was observed with benzoylacetonitrile and 3-oxo-3-phenylpropanamide substrates. However, since some nitrile hydrates enzymes presented great potential for the catalysis with the three substrates mentioned above and a recombinant keto reductase afforded excellent conversion and ee, the building block (S)-3-hydroxy-3-phenylpropanamide compound could be obtained in two different approaches of cascade reactions from the reduction/hydration reaction of the benzoylacetonitrile substrate. In the simultaneous multi-enzymatic cascade reaction approach, conversion was 83% and ee> 99% and in the sequential multi-enzymatic cascade reaction approach, conversion and ee was >99% in both steps, under environmentally friendly reaction conditions and without step of extraction and isolation of the intermediate. Therefore, these methodologies are promising for the development of a more sustainable process toward the synthesis of versatile compounds with high enantiomeric purity.
Multienzymatic cascades applied in the stereoselective synthesis of beta-hydroxyamides
Keywords: Reações em cascata; Beta-hidroxiamidas; Estereosseletividade; Biocatálise; Síntese assimétrica; Enzimas; Cascade reactions; Beta-hydroxyamides; Stereoselectivity; Biocatalysis; Asymmetric synthesis; Enzymes