Sensibilidade de biofilmes de Cryptococcus VNI e VGII à Anfotericina B e Maitenina - Benaducci, Tatiane [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2013)
Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os patógenos fúngicos mais comumente encontrados em infecções do sistema nervoso central, causando risco de vida por meningoencefalite e seus agentes podem crescer na forma de biofilme. No tratamento desta doença há poucas opções, além da problemática de resistência que pode estar também associada à formação de biofilmes. A procura por novos agentes antifúngicos, com reações adversas reduzidas, é necessária e os produtos naturais e seus derivados podem ser opções no tratamento das principais infecções fúngicas. Os objetivos deste estudo foram analisar isolados ambientais e clínicos de C. neoformans e C. gattii na forma planctônica e de biofilme, por diferentes técnicas de microscopia. Avaliar a sensibilidade a anfotericina B (AMB) e maitenina, molécula gerada a partir da planta Maytenus ilicifolia, bem como determinar a prevenção da formação de biofilmes, com base na análise de redução do 2,3-bis (2metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5 - [carbonilo (fenilamino)]-2H-tetrazólio-hidróxido (XTT) e na determinação da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Foi analisada ainda, a virulência dos isolados ambientais e clínicos de C. neoformans e C. gattii, em um modelo alternativo, a Galleria mellonella, e, realizada a quantificação relativa dos genes LAC1, URE1 e CAP59, envolvidos na virulência, pelo método de PCR em tempo real. As atividades metabólicas dos biofilmes de C. neoformans e C. gattii foram reduzidas cerca de 50% após o tratamento com 32,0 mg/L de ambos os antifúngicos, AMB e maitenina, para todos os micro-organismos testados. Por outro lado, as formas planctônicas tiveram concentração inibitória mínima (CIM) entre 0,5-4,0 mg/L de maitenina para os isolados de Cryptococcus spp., e para AMB todos permaneceram na faixa de concentração entre 0,5-1,0 mg/L. As concentrações de maitenina encontradas neste estudo (32,0 mg/L) não foram tóxicas para células de queratinócitos (NOK). Os isolados de C. neoformans e C. gattii que passaram pela formação de biofilme se mostraram mais virulentos que as planctônicas em G. mellonella. Para os genes LAC1 e URE1, C. gattii apresentou níveis mais elevados de expressão (p<0,001) que C. neoformans (p<0,05), sugerindo que C. gattii exibiu fatores de virulência que poderiam contribuir para seu fenótipo de patógeno primário mais virulento e a condição de biofilme poderia contribuir com esse perfil. Desta maneira, nossos resultados contribuem para o melhor entendimento dos agentes da criptococose quanto aos aspectos da interação levedura-hospedeiro-antifúngico.

Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are a fungal pathogen most commonly found in infections of the central nervous system causing life-threatening meningoencephalitis and can grow as a biofilm. The treatment of this disease there are few options, besides the problematic of resistance that can also be associated to the formation of biofilms. The search for new antifungal agents with reduced adverse reactions is necessary and natural products and their derivatives may be options in the treatment of major fungal infections. The objectives of this study were to analyze environmental and clinical isolates of C. neoformans and C. gattii in planktonic and biofilm form, by different microscopy techniques. To evaluate the sensitivity to amphotericin B (AMB) and maytenin, a molecule generated from the plant Maytenus ilicifolia, as well as to determine the prevention of biofilm formation, based on the reduction analysis of 2,3-bis (2methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl) -5- [carbonyl (phenylamino)] - 2H-tetrazolium hydroxide (XTT) and in determining the count of colony forming units (CFU). It was also analyzed the virulence of the environmental and clinical isolates of C. neoformans and C. gattii in an alternative model, Galleria mellonella, and the relative quantification of LAC1, URE1 and CAP59 genes involved in virulence by the Real-time PCR. The metabolic activities of the biofilms of C. neoformans and C. gattii were reduced by approximately 50% after treatment with 32.0 mg/L of both antifungals, AMB and maytenin, for all microorganisms tested. On the other hand, planktonic forms had minimal inhibitory concentration (MIC) between 0.5-4.0 mg/L of maytenin for Cryptococcus spp. isolates, and for AMB all remained in the concentration range between 0.5-1.0 mg/L. The concentrations of maytenin found in this study (32.0 mg/L) were not toxic to keratinocyte cells (NOK). The isolates of C. neoformans and C. gattii that underwent biofilm formation were more virulent than planktonic in G. mellonella. For the LAC1 and URE1 genes, C. gattii had higher expression levels (p <0.001) than C. neoformans (p <0.05), suggesting that C. gattii exhibited virulence factors that could contribute to its pathogen phenotype, and the biofilm condition could contribute to this profile. In this way, our results contribute to a better understanding of the cryptococcosis agents regarding the aspects of the yeast-host-antifungal interaction.
Sensibility of Cryptococcus VNI and VGII to Anfotericin B and Maitenin
Keywords: Cryptococcus spp.; Biofilmes; Concentração Inibitória Mínima (CIM); Maitenina; Galleria mellonella; Biofilms; Minimal Inhibitory Concentration (MIC); Maytenin