Avaliação do mecanismo de ação do protocatecuato de nonila em dermatófitos - Bonatti, Jean Lucas de Carvalho [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir os tecidos queratinizados do homem e dos animais, causando a dermatofitose, uma infecção cutânea, restrita à camada córnea. Existem poucos fármacos disponíveis para o tratamento das dermatofitoses, e os novos fármacos pertencem basicamente às famílias dos azóis e das alilaminas, sendo a maioria muitos tóxicos para as nossas células, uma vez que seus alvos celulares são limitados pela sua semelhança com a célula fúngica (ambas eucarióticas). Nosso grupo tem estudado a atividade do ácido protocatecuico e de seus derivados contra várias espécies de fungos, entre eles, dermatófitos como Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis e M. gypseum. Entre os derivados, o protocatecuato de nonila exibiu os melhores resultados, além de atividade potente contra os biofilmes de T. rubrum e T. mentagrophytes, que, pela primeira vez, foram caracterizados pelo nosso grupo. Porém, a descoberta do mecanismo de ação não foi elucidada. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo verificar o mecanismo de ação do protocatecuato de nonila em T. rubrum em relação aos danos na parede celular por meio de microscopia confocal, por microscopia eletrônica de transmissão, quantificação do ergosterol e de espécies reativas de oxigênio (ROS), determinar o mecanismo de morte por apoptose e necrose e analisar a expressão gênica diferencial por PCR em tempo real. O tratamento com 0,5mg/L do composto causou aumento dos vacúolos, além do desarranjo da membrana plasmática em algumas áreas, já em concentrações mais altas, a nonila causou danos mais severos, levando à lise da membrana, se assemelhando aos polienos. Na quantificação de ROS, a nonila apresentou resultados inferiores aos fármacos de controle, demonstrando que o composto não apresenta essa característica. Apesar dos danos causados pelo composto, aparentemente não houve comprometimento da estrutura da parede celular. A diminuição dos níveis de ergosterol, e a análise da expressão gênica por PCR e eletroforese capilar, mostraram que a nonila atua impedindo o processo final da biossíntese do ergosterol ao reprimir o gene ERG11, que codifica a enzima 14 α-demetilase, responsável pela conversão do lanosterol ao ergosterol. Isso é reforçado pelo alto índice de células mortas por necrose, onde o composto induziu morte celular em mais de 60% das células, enquanto não houve morte por apoptose. Portanto, o protocatecuato de nonila apresenta mecanismos de ação em alvos específicos nas estruturas fúngicas e tais mecanismos compartilham dos antifúngicos das classes dos azólicos e polienos.

Dermatophytes are fungi that have the ability to invade the keratinized tissues of humans and animals, causing dermatophytosis, a skin infection restricted to the stratum corneum. There are few drugs available for the treatment of dermatophytosis, and the new drugs basically belong to the families of azoles and allylamines, most being very toxic to our cells, since their cellular targets are limited by their similarity to the fungal cell (both eukaryotic). Our group has studied the activity of protocatechuic acid and its derivatives against several species of fungi, including dermatophytes such as Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis and M. gypseum. Among the derivatives, nonyl protocatechuate showed the best results, in addition to potent activity against the biofilms of T. rubrum and T. mentagrophytes, which, for the first time, were characterized by our group. However, the discovery of the mechanism of action has not been elucidated. Therefore, this study aimed to verify the mechanism of action of nonyl protocatechuate in T. rubrum in relation to cell wall damage through confocal microscopy, transmission electron microscopy, quantification of ergosterol and reactive oxygen species (ROS), determine the mechanism of death by apoptosis and necrosis and analyze differential gene expression by real-time PCR. Treatment with 0.5mg/L of the compound caused an increase in vacuoles, in addition to disarrangement of the plasma membrane in some areas, whereas at higher concentrations, nonyl caused more severe damage, leading to membrane lysis, resembling polyenes. In the quantification of ROS, nonyl showed lower results than the control drugs, demonstrating that the compound does not have this characteristic. Despite the damage caused by the compound, apparently there was no impairment of the cell wall structure. The decrease in ergosterol levels, and the analysis of gene expression by PCR and capillary electrophoresis, showed that nonyl acts by preventing the final process of ergosterol biosynthesis by repressing the ERG11 gene, which encodes the enzyme 14 α-demethylase, responsible for the conversion from lanosterol to ergosterol. This is reinforced by the high rate of cells killed by necrosis, where the compound induced cell death in more than 60% of the cells, while there was no death by apoptosis. Therefore, nonyl protocatechuate has mechanisms of action on specific targets in fungal structures and such mechanisms share the antifungals of the azole and polyene classes.
Evaluation of the mechanism of action of nonyl 3,4-dihydroxybenzoate in dermatophytes
Keywords: Dermatófitos; biofilmes; ácido protocatecuico; mecanismos de ação; Dermatophytes; biofilms; protocatechuic acid; mechanisms of action