Detecção e caracterização molecular de agentes transmitidos por vetores em aves silvestres no pantanal brasileiro - Alabí Córdova, Amir Salvador [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
- O presente estudo avaliou, por meio de técnicas moleculares, a ocorrência e a diversidade genética dos agentes Anaplasmataceae, Bartonella spp., Hepatozoon spp. e Borrelia spp. em aves silvestres no Pantanal dos estados de Mato Grosso (MT) e Mato Grosso do Sul (MS). Para tanto, 500 amostras de sangue de aves silvestres capturadas no Pantanal de MT e MS, durante o mês de abril e entre os meses de agosto e novembro de 2019, foram submetidas à extração de DNA e ensaios de PCR em tempo real e convencional baseados nos genes groEL, gltA, dsb, região intergênica 23S-5S, omp-1 e sodB para agentes Anaplasmataceae, nuoG, gltA, rpoB, ftsZ, pap31 e ribC para Bartonella spp., 16S rRNA e flaB para Borrelia spp., 18S rRNA para Hepatozoon spp. e cox-1, 12S rRNA e 28S rRNA para filarídeos. Análises filogenéticas foram construídas para posicionar filogeneticamente as sequências obtidas. Como resultado, 37/500 (7,4%) aves foram positivas para Anaplasma spp. e 4 (0,8%) para Ehrlichia spp. no ensaio qPCR (groEL); além disso, 13 (2,6%) foram positivos na PCR para agentes Anaplasmataceae com base no gene 16S rRNA. As sequências de 16S rRNA de Ehrlichia spp. detectadas foram posicionadas próximas a Ehrlichia sp. Magellanica. As sequências dsb de Ehrlichia detectadas agruparam-se com Ehrlichia minasensis. Os genótipos 16S rRNA de Anaplasma spp. detectados foram agrupados com 'Candidatus Allocryptoplasma spp.'. Os genótipos 23S-5S detectados foram relacionados a Anaplasma phagocytophilum. Dezenove (3,8%) das 500 amostras de sangue de aves foram positivas em ensaio de qPCR para Bartonella spp. com base no gene nuoG. Com base nos resultados do BLASTn, enquanto 1 sequência nuoG, 2 ribC e 2 ITS (16S-23S rRNA) apresentaram alta identidade com Bartonella henselae, uma 16S rRNA e 2 ITS apresentaram alta identidade com Bartonella machadoae. Três amostras (0,6%) foram positivas na PCR para filarídeos. Enquanto uma das sequências de cox-1 detectadas agrupou-se com Cardiofilaria sp., a outra posicionou-se basal a Splendidofilaria spp. Além disso, protocolos previamente estabelecidos de qPCR microfluídica em tempo real foram padronizados para a detecção de agentes transmitidos por vetores em 282 amostras de sangue de aves coletadas no Pantanal do estado de Mato Grosso em 2022, visando amplificar os genes 16S rRNA para Anaplasma spp., ssrA para Bartonella spp., cytB para hemosporídeos, e LSU rRNA para filariídeos. Os resultados foram validados por ensaios de PCR baseados no gene 16S rRNA e região intergênica 23S-5S para Anaplasma spp., espaçador intergênico 16-23S rRNA, e genes nuoG, gltA, pap31, ribC, ftsZ, groEL e rpoB para Bartonella spp., cox-1, 12S rRNA e 18S rRNA para filarídeos e gene cytB para hemosporídeos. As seguintes taxas de positividade foram encontradas na qPCR microfluídica de alto rendimento: 18.2% para Anaplasma spp., 6.5% para Onchocercidae, 6.2% para Plasmodium spp., 5.09% para Haemoproteus spp. e 0.36% para Bartonella spp. DNA de Bartonella machadoae, Cardiofilaria spp., Aproctella spp. e filarídeo posicionado basalmente ao clado de Eufilaria spp. foi detectado por esta técnica de qPCR. Em conclusão, novos genótipos de Anaplasma foram detectados em aves do Pantanal. Bartonella spp. relacionadas a B. machadoae e B. henselae foram detectadas, pela primeira vez, em aves silvestres do Pantanal brasileiro. Este é o primeiro relato molecular de filariídeos Onchocercidae (Aproctella spp., Cardiofilaria spp., e filarídeos basais a Eufilaria spp. e Splendidofilaria spp.) em aves do Pantanal brasileiro. A qPCR microfluídica em tempo real de alto rendimento mostrou-se eficiente na triagem de agentes transmitidos por vetores em aves silvestres no Brasil, desde que sejam desenhados primers específicos para variantes genotípicas circulantes no território nacional.

The present study evaluated, by means of molecular techniques, the occurrence and genetic diversity of agents Anaplasmataceae, Bartonella spp., Hepatozoon spp., and Borrelia spp. in wild birds in the Pantanal of the states of Mato Grosso (MT) and Mato Grosso do Sul (MS). To this end, 500 blood samples from wild birds captured in the Pantanal of MT and MS, during the month of April and between the months of August and November 2019, were subjected to DNA extraction and real-time and conventional PCR assays based on the groEL, gltA, dsb, intergenic region 23S-5S, omp-1 and sodB genes for Anaplasmataceae agents, nuoG, gltA, rpoB, ftsZ, pap31 and rib-C for Bartonella spp., 16S rRNA and flaB for Borrelia spp., 18S rRNA for Hepatozoon spp., and cox-1, 12S rRNA and 28S rRNA genes for filariids. Phylogenetic analyses were constructed to phylogenetically position the sequences obtained. As a result, 37/500 (7.4%) birds were positive for Anaplasma spp. and 4 (0.8%) for Ehrlichia spp. in the qPCR assay (groEL); in addition, 13 (2.6%) were positive in the PCR for Anaplasmataceae agents based on the 16S rRNA gene. The Ehrlichia 16S rRNA sequences detected were positioned near Ehrlichia sp. Magellanica. The Ehrlichia dsb sequences detected clustered with Ehrlichia minasensis. The Anaplasma spp. 16S rRNA genotypes detected clustered with 'Candidatus Allocryptoplasma spp.'. The 23S-5S genotypes detected in were related to Anaplasma phagocytophilum. Nineteen (3.8%) out of the 500 blood samples from birds were positive in a qPCR assay for Bartonella spp. based on the nuoG gene. Based on the BLASTn results, while 1 nuoG, 2 ribC and 2 ITS (16S-23S rRNA) sequences showed high identity with Bartonella henselae, one 16S rRNA and 2 ITS showed high identity with Bartonella machadoae. Three samples (0.6%) were positive in the PCR for filarids. While one cox-1 sequence detected clustered with Cardiofilaria sp., another one sequence was positioned basal to Splendidofilaria spp. In addition, previously established protocols of new microfluidic real-time PCR assays were standardized for the detection of vector-borne agents in 282 bird blood samples collected in the Pantanal of the state of Mato Grosso in 2022, aiming to amplify the 16S rRNA genes for Anaplasmataceae, ssrA gene for Bartonella spp., cytB for hemosporidians, and LSU rRNA for filariids. The results were validated by PCR assays based on the 16S rRNA gene and 23S-5S intergenic region for Anaplasma spp., 16-23S rRNA intergenic spacer, nuoG, gltA, pap31, ribC, ftsZ, groEL and rpoB genes for Bartonella spp., cox-1 for filariids and cytB gene for haemosporidians. The following positivity rates were found in high-throughput microfluidic qPCR: 18.2% for Anaplasma spp., 6.5% for Onchocercidae, 6.2% for Plasmodium spp., 5.09% for Haemoproteus spp. and 0.36% for Bartonella spp.. DNA from Bartonella machadoae, Cardiofilaria spp., Aproctella spp., and a filariid ancestral to Eufilaria spp. clade was detected by this new qPCR technique. In conclusion, novel genotypes of Anaplasma, Ehrlichia, and 'Candidatus Allocryptoplasma' were detected in birds from the Pantanal wetland. Bartonella spp. related to B. henselae and B. machadoae were detected, for the first time, in wild birds from the Brazilian Pantanal. This is the first molecular report of Borrelia spp. and onchocercid filariids (Aproctella spp., Cardiofilaria spp., and onchocercid filariids basal to Eufilaria spp. and Splendidofilaria spp. clade) in birds from the Brazilian Pantanal. High-throughput real-time microfluidic qPCR proved to be efficient in the screening of vector-borne agents in wild birds in Brazil as long as specific primers are designed for genotypic variants circulating in the national territory.
Molecular detection and characterization of vector-borne agents in wild birds in the brazilian pantanal
Keywords: Anaplasmataceae; Aves selvagens; Diagnostico molecular; Filogenia; Biologia molecular; Parasitologia veterinária