Construção de um sistema autônomo da expressão gênica em Bacillus subtilis - Silva, Bruna Fernandes [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Os métodos de indução da expressão gênica disponíveis para a construção de linhagens bacterianas envolvem a adição de compostos indutores ao meio de cultura, o que é indesejável para aplicações industriais, pois encarece o processo produtivo. Já a utilização da expressão constitutiva, alternativa à indução, pode ocasionar estresse metabólico durante o crescimento celular por conta da síntese intensa e contínua do produto. Para solucionar este problema, são utilizados sistemas capazes de monitorar e regular de maneira autônoma a expressão gênica, baseado no mecanismo de quorum sensing (QS) bacteriano. Em estudos anteriores, um modelo funcional de controle e indução da expressão gênica foi construído em Bacillus subtilis, podendo ser conectado à síntese de biomoléculas de interesse industrial, como a riboflavina (vitamina B2). O metabolismo de riboflavina está diretamente ligado à ação da enzima RibC, que catalisa a conversão desta vitamina em FMN e FAD nas células. Deste modo, a funcionalidade do modelo pode ser ampliada pela repressão gênica da produção de RibC, favorecendo uma maior produção de riboflavina. O design do circuito gênico que conecta o sistema de autoindução à síntese de riboflavina, bem como as simulações in silico do funcionamento foram feitos no software iBioSim 3.1. Os resultados mostraram que o modelo de indução combinado com a repressão pelo sistema LuxRI leva a um aumento da produção de riboflavina. Os testes com as linhagens de B. subtilis construídas evidenciaram que o sistema LuxRI foi capaz de induzir e reprimir a expressão gênica de forma autônoma e simultânea, levando a produção de 17,8 mg/L de riboflavina por células.

The available methods for induction of gene expression in bacterial strains use inducing compounds added to the culture medium, which is undesirable for industrial applications as it increases the production costs. Constitutive expression, an alternative to induction, can cause metabolic stress during cell growth due to the intense and continuous synthesis of the product. To solve this problem, systems capable of sensing and regulating gene expression autonomously, based on bacterial quorum sensing (QS) process are used. In previous studies, a functional model for the control and induction of gene expression has been built in Bacillus subtilis. It has been demonstrated to control the synthesis of biomolecules of industrial interest, such as riboflavin (vitamin B2). Riboflavin metabolism is directly linked to the activity of the enzyme RibC, which catalyzes the conversion of the vitamin into FMN and FAD in the cells. Therefore, the autoinduction process can be extended to gene repression of ribC, favoring riboflavin accumulation. The gene circuit design connecting the autoinduction system to riboflavin synthesis as well as in silico simulations were performed using the iBioSim 3.1 software. Our results showed that the induction model combined with repression by the LuxRI system leads to increased riboflavin production. Tests with engineered B. subtilis strains evidenced that the LuxRI system was able to induce and repress gene expression autonomously and simultaneously, leading to the production of 17.8 mg/L of riboflavin per cell.
Keywords: Expressão gênica; quorum sensing; Bacillus subtilis; riboflavina; RibC