Modulação gênica de neutrófilos humanos após infecção in vitro com Leishmania infantum - Scaramele, Natalia Francisco [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A leishmaniose é uma zoonose tropical negligenciada com altas taxas de morbidade e mortalidade. É causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitida durante o repasto sanguíneo das fêmeas de Lutzomyia longipalpis. Uma das manifestações clínicas da doença é a leishmaniose visceral, causada principalmente pela espécie L. infantum (syn. chagasi) nas Américas. Os sintomas da leishmaniose visceral incluem febre, anorexia, perda de peso, distensão abdominal, fraqueza e um aumento abdominal significativo, decorrente de hepato e esplenomegalia. Apesar da disponibilidade de medicamentos para tratar a doença, nenhuma vacina está comercialmente disponível para humanos. O papel dos neutrófilos como parte da resposta inata à Leishmania spp. infecção é duvidosa e varia de acordo com a espécie causadora da infecção. Ainda, a expressão global de RNAs codificantes, microRNAs e RNAs longos não codificantes muda como parte da resposta imune contra patógenos. No presente trabalho buscamos entender os padrões de expressão gênica de transcritos (codificantes e não codificantes) em neutrófilos humanos infectados in vitro com L. infantum. Isolamos neutrófilos de sangue total de doadores saudáveis do sexo masculino (n=5) e dividimos em grupos: 1) infectados com L. infantum (MOI = 5:1) e 2) controles não infectados. No grupo infectado as promastigotas não internalizadas após 3 horas foram removidas e, ao tempo de 20 horas pós-infecção o RNA total foi extraído das células dos grupos controle e infectado. Posteriormente foram realizadas duas técnicas: 1) sequenciamento de RNA total, e 2) microarranjo de microRNA. Observamos mudanças na expressão de 212 transcritos (log2(FC)±0,58, FDR≤0,05), sendo classificados: 202 RNAs mensageiros, seis RNAs longos não-codificantes, um RNA “miscellaneous”, um RNA nuclear pequeno, um pseudogene não processado e um pseudogene processado. E na expressão de 289 microRNAs (FC±2, FDR≤0,01). Com o auxílio de ferramentas bioinformáticas, pudemos ainda predizer funções biológicas aos nossos achados, e com isso inferimos que as mudanças observadas tanto na expressão de RNAs codificadores como dos não codificadores de neutrófilos estão associadas ao prejuízo na fagocitose, produção de óxido nítrico e de citocinas pró-inflamatórias após a infecção com L. infantum, favorecendo a persistência do parasito. Nosso trabalho lança luz sobre vários mecanismos utilizados pela L. infantum para controlar a resposta imune mediada por neutrófilos e identifica vários alvos para futuros estudos funcionais, visando o desenvolvimento de tratamentos preventivos ou curativos para esta prevalente zoonose.

Leishmaniasis is a neglected tropical zoonosis with high morbidity and mortality rates. It is caused by protozoa of the genus Leishmania and transmitted during the blood meal of female Lutzomyia longipalpis. One of the clinical manifestations of the disease is visceral leishmaniasis, caused mainly by the species L. infantum (syn. chagasi) in the Americas. Symptoms of visceral leishmaniasis include fever, anorexia, weight loss, abdominal distention, weakness, and significant abdominal enlargement due to hepatomegaly and splenomegaly. Despite the availability of drugs to treat the disease, no vaccine is commercially available for humans. The role of neutrophils as part of the innate response to Leishmania spp. infection is dubious and varies according to the species causing the infection. Furthermore, the global expression of coding RNAs, microRNAs and long non-coding RNAs changes as part of the immune response against pathogens. In the present work, we aimed to understand the gene expression patterns of coding and non-coding transcripts of human neutrophils infected in vitro with L. infantum. We isolated whole blood neutrophils from healthy male donors (n=5) and divided them into groups: 1) infected with L. infantum (MOI = 5:1) and 2) uninfected controls. In the infected group, the non-internalized promastigotes were removed after 3 hours and at the time of 20 hours post-infection, the total RNA was extracted from control and infected neutrophils. Subsequently, two techniques were performed: 1) total RNA sequencing, and 2) microRNA microarray. We observed changes in the expression of 212 transcripts (log2(FC)±0.58, FDR≤0.05), being classified: 202 messenger RNAs, six long non-coding RNAs, one “miscellaneous” RNA, one small nuclear RNA, one unprocessed pseudogene and one processed pseudogene. We also observed changes in the expression of 289 microRNAs (FC±2, FDR≤0.01). With the aid of bioinformatics tools, we were also able to predict biological functions to our findings, inferring that the changes observed in the expression of both coding and non-coding RNAs are associated with impaired phagocytosis, production of nitric oxide and cytokines pro-inflammatory reactions after neutrophils infection with L. infantum, favoring the persistence of the parasite. Our work sheds light on several mechanisms used by L. infantum to control the neutrophil-mediated immune response and identifies several targets for future functional studies, aiming at the development of preventive or curative treatments for this prevalent zoonosis.
Gene modulation of human neutrophils after in vitro infection with Leishmania infantum
Keywords: Leishmaniose; RNA Mensageiro; MicroRNAs; RNA Longo não Codificante; Neutrófilos; Imunidade Inata; Leishmaniasis; RNA, Messenger; RNA, Long Noncoding; Neutrophils; Immunity, Innate