Efeitos da membrana Cellfate®, associada à adição de melatonina no meio de cultivo, na produção e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro - Mendes, Adriano Felipe [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
A hipótese é que a utilização do sistema de cultivo tridimensional (3D) com o emprego de uma membrana de nanocelulose bacteriana (CellFate®; Biocelltis S.A., Brasil), durante a maturação oocitária (MIV) e cultivo embrionário (CIV) associada à adição de melatonina na MIV, aumenta a produção e qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, esta tese foi construída em três capítulos: revisão de literatura (Capítulo 1); efeito dose-resposta da melatonina adicionada durante a MIV e/ou CIV no sistema de cultivo convencional (bidimensional, 2D) na produção e qualidade embrionária (Capítulo 2; Estudo 1) e associação do cultivo 3D (CellFate®) na MIV e CIV, com a adição de 10 µM (10000 nM) de melatonina na MIV sobre a produção e qualidade embrionária (Capítulo 3; Estudo 2). No estudo 1, objetivou-se avaliar os efeitos de 0,01, 10 e 10000 nM de melatonina (Sigma Aldrich, M5250), durante a MIV (Experimento 1), CIV (Experimento 2) e MIV e CIV (Experimento 3). Dessa forma, ovários de fêmeas Nelore (Bos taurus indicus) foram coletados em abatedouro e oócitos derivados desses ovários foram submetidos à MIV por 24 horas em meio próprio acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), além dos tratamentos. A seguir, oócitos e espermatozoides forma co-cultivados por 18 horas. Os prováveis zigotos foram transferidos para o meio fluido sintético de oviduto acrescido com 2,5% de SFB, além dos tratamentos, onde foram cultivados por 9 dias. Todas as etapas foram realizadas gotas de cultivo submersas em óleo mineral para cultivo dispostas em placas de Petri em incubadora a 38,5°C e atmosfera úmida com 5% de CO2. A taxas de clivagem, blastocisto e eclosão foram avaliadas aos 3, 7 e 9 dias de cultivo, considerando a FIV como dia 0 (D0). Aos 9 dias, blastocistos eclodidos foram colhidos para avaliar a expressão de OCT4 (POU class 5 homeobox 1), SOD2 (superoxide dismutase 2), GPX1 (glutathione peroxidase 1), e BAX (BCL2 associated X) por RT-qPCR. Os dados foram submetidos à análise de variância seguida da aplicação de contrastes. A taxa de clivagem não foi alterada nos três experimentos. No Experimento 1, o uso de melatonina no D7 determinou uma tendência para maior número de blastocistos eclodidos (P = 0,0686) e totais (P = 0,0892) no grupo 10000 nM comparado ao grupo 0,01 nM. No D9, observou-se maior número de blastocistos totais (P = 0,0216) no grupo 10000 nM comparado ao grupo 0,01 nM e uma tendência (P = 0,0741) de maior número de blastocistos eclodidos no grupo 10000 nM comparado ao grupo 0,01 nM. Não foram observadas diferenças para a RT-qPCR. Nos experimentos 2 e 3 não foram observadas diferenças significativas na produção embrionária. Em conclusão, a adição com melatonina apenas na MIV determina uma tendência para melhores taxas de produção embrionária quando 10000 nM foi comparado a 0,01 nM e que tal adição não alterou a expressão dos transcritos OCT4, SOD2, GPX1 e BAX. No estudo 2, objetivou-se avaliar o efeito do sistema 3D na MIV, CIV ou MIV e CIV, bem como o impacto de 10 µM de melatonina na MIV na presença ou não do sistema 3D durante a MIV. Ovários de fêmeas Bos taurus indicus × Bos taurus taurus foram colhidos em abatedouro para a recuperação oocitária. As etapas de MIV, FIV e CIV, bem como as análises seguiram o protocolo descrito para o Estudo 1, exceto que todas as etapas foram realizadas placas de 4 poços. O sistema 3D com melatonina apresentou maior taxa de clivagem em D3 comparado ao controle (P = 0,0300) e ao sistema 3D sem melatonina (P = 0,0313). No D7, o sistema 3D com melatonina apresentou maior taxa de blastocisto inicial comparado ao controle (P = 0,0079). No D9, o sistema 3D com melatonina apresentou maior taxa de blastocisto expandido comparado ao sistema 3D sem melatonina (P = 0,0491), maior taxa de blastocisto geral comparado aos grupos controle (P = 0,0160) e sistema 3D sem melatonina (P = 0,0193). A utilização do sistema 3D isolado na MIV resultou em taxa de blastocisto geral semelhante ao sistema 3D com melatonina, sendo esses dois sistemas superiores aos sistemas 3D sem melatonina, 3D somente no CIV e controle (P = 0,0323). Em conclusão, o sistema 3D com ou sem melatonina, resulta em maior taxa de blastocisto geral no D9, sem alterar a expressão de OCT4, GPX1, SOD2 e BAX em embriões bovinos. Com base nos dois estudos, conclui-se que a utilização de 10 µM, bem como a utilização do sistema 3D CellFate® melhoram produção embrionária in vitro.

The possibility is that the use of the three-dimensional (3D) culture system, with the use of a bacterial nanocellulose membrane (CellFate®), during in vitro oocyte maturation (IVM) and in vitro embryonic culture (IVC) associated with the addition melatonin in OM increases the production and quality of bovine embryos produced in vitro. To achieve this, this thesis was constructed in three chapters: literature review (Chapter 1); dose-response effect of melatonin added during IVM and/or IVC in the conventional culture system (two-dimensional, 2D) on embryonic production and quality (Chapter 2; Study 1) and association of 3D culture (CellFate®) in IVM and IVC, with the addition of 10 µM (10000 nM) of melatonin in IVM on embryonic production and quality (Chapter 3; Study 2). In study 1, the objective was to evaluate the effects of 0.01, 10 and 10000 nM of melatonin (Sigma Aldrich, M5250), during IVM (Experiment 1), IVC (Experiment 2) and IVM and IVC (Experiment 3). Thus, ovaries from Nellore females (Bos taurus indicus) were collected in a slaughterhouse and oocytes derived from these ovaries were subjected to IVM 24 hours in specific medium with 10% fetal bovine serum (FBS), in addition to the treatments. Next, oocytes and sperm are formed co-cultured 18 hours. The probable zygotes were transferred to the synthetic fluid oviduct medium added with 2.5% FBS, in addition to the treatments, where they were cultured for 9 days. All stages were carried out in drops of cultivation submerged in oil for interested cultivation in Petri dishes in an incubator at 38.5°C and a humid atmosphere with 5% CO2. Cleavage, blastocyst and hatching rates were evaluated at 3, 7 and 9 days of culture, respectively, considering IVF as day 0 (D0). At 9 days, hatched blastocysts were collected to evaluate the expression of OCT4 (POU class 5 homeobox 1), SOD2 (superoxide dismutase 2), GPX1 (glutathione peroxidase 1), and BAX (BCL2 associated X) by RT-qPCR. The data were subjected to analysis of variance followed by the application of contrasts. The cleavage rate was not changed in the three experiments. In Experiment 1, the use of melatonin determined on D7, a tendency for a greater number of hatched (P = 0.0686) and total (P = 0.0892) blastocysts in the 10000 nM group compared to the 0.01 nM group. On D9, we encouraged a greater number of total blastocysts (P = 0.0216) in the 10000 nM group compared to the 0.01 nM group and a tendency (P = 0.0741) for a greater number of blastocysts hatched in the 10000 nM group compared to the 0.01 nM group. No differences were observed for RT-qPCR. In experiments 2 and 3, no important differences in embryo production were observed. In conclusion, the addition of melatonin only to IVM determines a trend towards better embryonic production rates when 10000 nM was compared to 0.01 nM and that such addition did not alter the expression of OCT4, SOD2, GPX1 and BAX transcripts. In study 2, the aim was to evaluate the effect of the 3D system on IVM, IVC or IVM and IVC, as well as the impact of 10 µM melatonin on IVM in the presence or absence of the 3D system during an IVM. Ovaries from Bos taurus indicus × Bos taurus taurus females were collected in a slaughterhouse for oocyte recovery. The IVM, IVF and IVC steps, as well as the analyzes followed the protocol described for Study 1, except that all steps were performed in 4-well plates. The IVM, IVF and IVC steps, as well as the analyzes followed the protocol described for Study 1. The 3D system with melatonin showed higher cleavage rates in D3 compared to control (P = 0.0300) and to the 3D system without melatonin (P = 0.0313). On D7, the 3D system with melatonin showed higher early blastocyst rates compared to the control (P = 0.0079). On D9, the 3D system with melatonin showed higher expanded blastocyst rates compared to the 3D system without melatonin (P = 0.0491), higher overall blastocyst rates compared to the control (P = 0.0160) and 3D system without melatonin groups. melatonin (P = 0.0193). The use of the 3D system alone in IVM resulted in an overall blastocyst rate similar to the 3D system with melatonin, with these two systems being superior to the 3D systems without melatonin, 3D only in IVC and control (P = 0.0323). In conclusion, the 3D system with or without melatonin results in higher overall blastocyst rates at D9, without altering the expression of OCT4, GPX1, SOD2 and BAX in bovine embryos. Based on our two studies, in conclusion, the use of 10 µM as well as the use of the 3D CellFate® system improves in vitro embryo production.
Effects of the Cellfate® membrane, associated with the addition of melatonin in the culture medium, on the production and quality of bovine embryos produced in vitro
Keywords: Reprodução; Oócito; Embrião; Antioxidante; Cultura tridimensional