Generation of T. cruzi strains knock-out for IP6K and evaluation of the resulting phenotypes - Abuchery, Bryan Etindi [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi. Não existem vacinas eficazes e as opções de tratamento disponíveis são eficazes apenas na fase aguda da doença, mas podem causar efeitos colaterais graves nos pacientes. Assim, a busca pela elucidação de vias moleculares que possam fornecer potenciais alvos para o desenvolvimento de fármacos é de suma importância. Pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos em eucariotos. No entanto, o mecanismo de ação desses metabólitos ainda não é totalmente compreendido. IP7 e IP8 são sintetizados por vias envolvendo a participação de IP6K e PP-IP5K quinases, respectivamente. Os tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas não possuem ortólogos para PP-IP5K, tornando-os excelentes modelos para estudar IP7. Aqui, usando a abordagem CRISPR/Cas9, interrompemos alelos simples e duplos de IP6K, gerando linhagens IP6K-/+ e IP6K-/-, respectivamente. A inativação do IP6K causa vários efeitos morfológicos, como arredondamento e enrugamento do corpo celular, aumento do número de glicossomos e aumento mitocondrial. Notavelmente, a linhagem IP6K-/- (duplo nulo) foi incapaz de proliferar por mais de 7 dias, sugerindo que esta quinase é essencial para este organismo. Curiosamente, a linhagem IP6K-/+ (single-null) mostrou uma leve parada do ciclo celular na fase G0/G1 sem nenhum dano ao DNA (células quiescentes). Além disso, a linhagem IP6K-/+ mostrou uma alta capacidade proliferativa dentro da célula hospedeira de mamífero, sugerindo que as células quiescentes observadas podem ser formas metacíclicas. Juntos, nossos resultados sugerem que a perda total de IP6K tem consequências prejudiciais para o T. cruzi. No entanto, paradoxalmente, o rompimento de um único alelo do IP6K faz com que o T. cruzi fique propenso a se multiplicar ainda mais dentro da célula hospedeira, gerando um enigma que ainda estamos tentando entender.

Chagas disease is a neglected tropical disease caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi. There are no effective vaccines and the available treatment options are effective only in the acute phase of the disease but can cause serious side effects on the patients. Thus, the search for the elucidation of molecular pathways that may provide potential targets for drug development is of paramount importance. Inositol pyrophosphates (PP-IPs) – mainly IP7, and IP8 – are involved in a wide range of processes in eukaryotes. However, the mechanism of action of these metabolites is not yet fully understood. IP7 and IP8 are synthesized by pathways involving the participation of IP6K and PP-IP5K kinases, respectively. Trypanosomatids have an ortholog gene for IP6K but do not have orthologs for PP-IP5K, making them excellent models for studying IP7. Here, using CRISPR/Cas9 approach, we disrupted single and double alleles of IP6K, generating IP6K-/+ and IP6K-/- lineages, respectively. IP6K inactivation causes several morphological effects, such as rounding and wrinkling of the cell body, increased number of glycosomes, and mitochondrial enlargement. Notably, IP6K-/- lineage (double-null) was unable to proliferate for more than 7 days, suggesting that this kinase is essential for this organism. Interestingly, IP6K-/+ lineage (single-null) showed a slight cell cycle arrest at G0/G1 phase with no DNA damage (quiescent cells). Moreover, the IP6K-/+ lineage showed a high proliferative capacity within the host mammalian cell, suggesting that the quiescent cells observed may be metacyclic forms. Together, our findings suggest that the total loss of IP6K has harmful consequences for T. cruzi. However, paradoxically, the disruption of a single allele of IP6K leads to T. cruzi being prone to multiplying further inside the host cell, generating a conundrum that we are still trying to understand.
Geração de circulas de T. cruzi knock-out para IP6K e avaliação dos fenótipos resultantes
Keywords: CRISPR/Cas9; Pirofosfatos de inositol; Pirofosforilação; Trypanosoma cruzi; Inositol pyrophosphates; Pyrophosphorylation; Chagas, Doença de; Proteína 9 Associada à CRISPR; Fosfatos de Inositol; Fenótipo