Geração e caracterização de tecido equivalente endotelial e seu potencial osteopromotor - Feltran, Georgia da Silva [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
Com o aumento progressivo da expectativa de vida da população, defeitos ósseos se tornou um problema de saúde pública. Por sua vez, o sistema esquelético abriga um conjunto de células que, de maneira hierárquica, sustentam a formação do osso ao longo da vida, sendo sua capacidade regenerativa comprometida durante o processo de envelhecimento. Com o aumento da expectativa de vida, a população idosa vem crescendo nos últimos anos e com ela o aumento eminente de fraturas ósseas. Sabe-se que o desenvolvimento e regeneração ósseos são eventos complexos e controlados por mecanismos parácrinos de sinalização intercelulares, destacando que a osteogênese está acoplada, principalmente, à angiogênese. Embora relatado, este mecanismo de comunicação entre células endoteliais e células osteoprogenitoras não está bem elucidado, sobretudo considerando o repertório de moléculas tróficas envolvidas. A fim de compreender melhor estes mecanismos, o objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologias capazes de mimetizar o microambiente endotelial-ósseo, bem como desvendar eventos acoplados entre os diferentes tipos celulares envolvidos no processo, sobretudo gerando tecido endotelial in vitro, equivalente ao original. Para isso, fizemos uso de células humanas primárias, as quais foram submetidas a diferentes protocolos experimentais, onde a mesma densidade de células endoteliais arterial (HCAEC) e venosa (HUVEC) e de musculatura lisa (AoSMC) (cultivo misto) foi plaqueada em tubos cônicos sem tratamento e, após 72 horas, os esferóides gerados foram tecnicamente processados para caracterização bioquímica (expressão das proteínas CD31 e α-SMA pelas células endoteliais e musculares lisa, respectivamente), estrutural (através de microscopia eletrônica) e morfológica (avaliações histológicas). Os resultados obtidos demonstram uma sequência experimental capaz de gerar esferóides de tecido endotelial com propriedades funcionais. Como nota, essas análises preliminares mostram uma concentração de células endoteliais (positivas para CD31+) ao centro do esferóide, enquanto células de musculatura lisa concentram-se perifericamente (positivas para α-SMA), estabelecendo uma distribuição hierárquica-estrutural entre as duas linhagens primárias. Os dados moleculares aqui obtidos evidenciam que estes eventos de homeostase do tecido requerem processamento de microRNAs (miRs) e envolvimento do fator indutor de hipóxia (HIF-1α), o qual foi significantemente mais expresso por células de musculatura lisa, localizada na periferia do tecido gerado. Os resultados mostram ainda que os esferóides gerados expressam biomarcadores osteogênicos (RUNX 2, OTX, ALP), podendo, assim, contribuir com eventos de diferenciação osteoblástica. Variando estratégias experimentais através da modulação da atividade de HIF-1α, mostramos haver efeito diferencial entre esferóides arteriais e venosos, em processos de diferenciação osteoblástica a partir de células indiferenciadas (CTM-MS). Em conjunto, os dados demonstram que a metodologia investigada fornece um fluxo experimental capaz de gerar um modelo de cultura 3D de tecido equivalente endotelial venoso e arterial, com propriedades celulares, bioquímicas e ultra-estruturais definidas, capazes de contribuírem paracrinamente com a fenótipo osteogênico com envolvimento dinâmico e diferencial de HIF-1α.

With the progressive increase in the life expectancy of the population, bone defects became a public health problem. In turn, the skeletal system houses a set of cells that, in a hierarchical way, support the formation of the bone throughout life, and its regenerative capacity is compromised during the aging process. With the increase in life expectancy, the elderly population has been increasing in recent years and with it the eminent increase of bone fractures. It is known that bone development and regeneration are complex events and controlled by paracrine mechanisms of intercellular signaling, emphasizing that osteogenesis is mainly coupled with angiogenesis. Although reported, this mechanism of crosstalk between endothelial cells and osteoprogenitor cells is not well elucidated, especially considering the repertoire of involved trophic molecules. In order to better understand these mechanisms, the objective of this work was to develop methodologies capable of mimicking the endothelial-bony microenvironment, as well as unveiling the coupled events between the different cell types involved in the process, especially generating endothelial tissue in vitro, equivalent to the original one. For this, we used primary human cells, which were submitted to different experimental protocols, where the same density of arterial (HCAEC) and venous (HUVEC) endothelial cells and smooth muscle cell (AoSMC) (mixed culture) were plated in tubes (s), and after 72 hours the generated spheroids were technically processed for biochemical characterization (expression of CD31 and α-SMA proteins by smooth muscle and endothelial cells, respectively), structural (through electron microscopy) and morphological (histological evaluations). The results obtained demonstrate an experimental sequence capable of generating endothelial tissue spheroids with functional properties. As a note, these preliminary analyzes show a concentration of endothelial cells (positive for CD31) at the center of the spheroid, while smooth muscle cells concentrate peripherally (positive for α-SMA), establishing a hierarchical-structural distribution between the two primary lineages . The molecular data obtained here evidenced that these tissue homeostasis events require the processing of microRNAs (miRs) and involvement of the hypoxia inducing factor (HIF-1α), which was significantly more expressed by smooth muscle cells located at the periphery of the tissue generated. The results also show that the generated spheroids express osteogenic biomarkers (RUNX 2, OTX, ALP), thus contributing to osteoblastic differentiation events. By varying experimental strategies by modulating the activity of HIF-1α, we show a differential effect between arterial and venous spheroids in processes of osteoblastic differentiation from undifferentiated cells (CTM-MS). Together, the datas demonstrate that the methodology investigated provides an experimental flow capable of generating a model of 3D culture of venous and arterial equivalent endothelial tissue, with defined cellular, biochemical and ultrastructural properties, capable of contributing in a way to the osteogenic phenotype with dynamic and differential involvement of HIF-1α.
Generation and characterization of endothelial equivalent tissue and its osteopromotor potential
Keywords: Osso; Células Ósseas; Células Endoteliais; Tecido ósseo; Bone; Bone cells; Endothelial Cells; Bone tissue; Spheroids