Potencial sistema nanoemulsionado carregado com hesperitina e canabidiol: desenvolvimento, caracterização e avaliação in vitro do seu impacto na polarização fenotípica de macrófagos - Durão, Letícia Pereira Lima [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
Terapias alternativas combinando produtos naturais têm sido utilizadas nos últimos anos como alternativa ou complementação de tratamentos convencionais. A hesperitina (HT), é um flavonoide, presente em frutas cítricas, com propriedades biológicas, incluindo ação antioxidante, anti-inflamatória e analgésica. Por outro lado, o canabidiol (CBD), é um composto pertencente a classe dos canabinoides, isolado da planta Cannabis Sativa, com efeitos farmacológicos benéficos como anti-inflamatórios, antioxidantes e na regeneração óssea e tecidual. Atualmente, as nanobiotecnologias estão abrindo novas perspectivas para a liberação controlada de medicamentos. Nesse sentido, as nanoemulsões (NEs) mostram resultados promissores devido à sua estrutura e notáveis propriedades biológicas. Assim, o objetivo do presente estudo foi desenvolver e caracterizar um novo sistema nanoemulsionado carregado com HT e CBD isolados e associados, e avaliar seus efeitos na polarização fenotípica, anti-inflamatórios e antioxidantes em macrófagos. Na publicação 1 foi realizada uma revisão narrativa sobre o papel do CBD na cicatrização de feridas através do seu efeito anti-inflamatório e regeneração tecidual óssea, fornecendo embasamento para as investigações subsequentes. Já na publicação 2, foi desenvolvido e validado um método para quantificação do CBD em NEs. Finalmente, na publicação 3, as NEs foram sintetizadas e carregadas com HT e CBD isolados e associados. A caracterização das NEs incluiu a análise dos parâmetros: diâmetro médio de gotícula, índice de polidispersão (IPd), potencial zeta, eficiência de encapsulação, liberação e internalização, além do tamanho e morfologia das partículas. Depois, o efeito das NEs sobre o perfil fenotípico M1 em macrófagos foi avaliado por citometria de fluxo, enquanto a modulação de mediadores inflamatórios foi analisada por RT-PCR e a expressão de espécies reativas de oxigênio (EROs) determinada usando a sonda fluorescente DCF-DA. Os dados numéricos foram submetidos à análise estatística, adotando-se um nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados indicaram que o CBD tem efeitos modulatórios na cicatrização de feridas e ossos atuando nos estágios envolvidos. Entretanto, sua eficácia é limitada devido à sua baixa biodisponibilidade, metabolismo rápido e solubilidade reduzida. Por outro lado, o método validado demonstrou alta sensibilidade para análise das NEs apresentando linearidade de 2,5 a 75 μg/mL, coeficiente de correlação de 0,9998, taxas de recuperação maiores a 85%, além de ser preciso, exato, robusto e seletivo. Finalmente, as NEs mostraram propriedades ideais de caraterização com gotículas <100 nm, IPd<0,5 e potencial zeta adequado. Adicionalmente, a alta eficiência de encapsulação facilitou uma liberação gradual e controlada. As NEs apresentaram internalização eficaz, mantendo uma morfologia esférica e sem coalescência. Por fim, o estudo in vitro demonstrou que as NEs são biocompatíveis, modulam a polarização de macrófagos M1 através supressão da expressão dos genes IL-6 e TNF-α e inibição significativa da produção de EROs. Em conclusão, a revisão reforça o potencial terapêutico do CBD na regeneração tecidual e óssea, no entanto há necessidade de novos estudos para avaliação do mecanismo de ação, biodisponibilidade e posologia do CBD. O método de quantificação do CBD em NE proposto foi validado demonstrando-se sensível e confiável. Finalmente, as NEs com HT e CBD demonstraram efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes, configurando-se como agentes promissores no tratamento de doenças inflamatórias, como a periodontite.

Alternative therapies combining natural products have been used in recent years as an alternative or complement to conventional treatments. Hesperitin (HT) is a flavonoid found in citrus fruits with biological properties, including antioxidant, anti-inflammatory and analgesic action. On the other hand, cannabidiol (CBD) is a compound belonging to the cannabinoid class, isolated from the Cannabis Sativa plant, with beneficial pharmacological effects such as anti-inflammatory, antioxidant, and bone and tissue regeneration properties.Currently, nanobiotechnologies are opening up new perspectives for the controlled release of drugs. In this sense, nanoemulsions (NEs) show promising results due to their structure and remarkable biological properties. Thus, the objective of the present study was to develop and characterize a new nanoemulsified system loaded with isolated and associated HT and CBD, and to evaluate its effects on phenotypic polarisation, anti-inflammatory and antioxidant properties in macrophages. In publication 1, a narrative review was conducted on the role of CBD in wound healing through its anti-inflammatory effect and bone tissue regeneration, providing a basis for subsequent investigations. In publication 2, a method for quantifying CBD in NEs was developed and validated. Finally, in publication 3, NEs were synthesised and loaded with isolated and associated HT and CBD. The characterization of NEs included the analysis of the following parameters: mean droplet diameter, polydispersity index (PDI), zeta potential, encapsulation efficiency, release and internalization, as well as particle size and morphology. Then, the effect of NEs on the M1 phenotypic profile in macrophages was evaluated by flow cytometry, while the modulation of inflammatory mediators was analysed by RT-PCR and the expression of reactive oxygen species (ROS) was determined using the DCF-DA fluorescent probe. The numerical data were submitted to statistical analysis, adopting a significance level of 5% (p<0.05). The results indicated that CBD has modulatory effects on wound and bone healing by acting on the stages involved. However, its efficacy is limited due to its low bioavailability, rapid metabolism, and reduced solubility. On the other hand, the validated method demonstrated high sensitivity for NE analysis, presenting linearity from 2.5 to 75 μg/mL, a correlation coefficient of 0.9998, recovery rates greater than 85%, and being precise, accurate, robust, and selective. Finally, NEs showed ideal characterization properties with droplets <100 nm, IPd<0.5, and adequate zeta potential. Additionally, the high encapsulation efficiency facilitated gradual and controlled release. The NEs showed effective internalization, maintaining a spherical morphology and without coalescence. Finally, the in vitro study demonstrated that NEs are biocompatible, modulate M1 macrophage polarization through suppression of IL-6 and TNF-α gene expression and significant inhibition of ROS production. In conclusion, the review reinforces the therapeutic potential of CBD in tissue and bone regeneration; however, further studies are needed to evaluate the mechanism of action, bioavailability, and dosage of CBD. The proposed method for quantifying CBD in NEs was validated as sensitive and reliable. Finally, NEs with HT and CBD demonstrated anti-inflammatory and antioxidant effects, making them promising agents in the treatment of inflammatory diseases such as periodontitis
Potential nanoemulsion system loaded with hesperetin and cannabidiol: development, characterization, and in vitro evaluation of its impact on macrophage phenotypic polarization
Keywords: Flavonoides; Canabidiol; Sistemas de Liberação de Fármacos por Nanopartículas; Macrófagos; Doenças periodontais; Inflamação; Flavonoids; Nanoparticle drug delivery system; Macrophages; Periodontal diseases; Inflammation.