Abordagem dual na investigação da proteína GRB2: exploração da interação específica e análise dinâmica do enovelamento - Pedro, Renan Pereira [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
As células estão sujeitas a processos de regulação associados à sobrevivência, crescimento, diferenciação e apoptose. Durante o ciclo de proliferação celular, eventuais falhas podem resultar em um crescimento celular descontrolado, levando ao desenvolvimento de tumores. A via de sinalização MAPK é uma das vias impactadas por essas alterações, com a proteína adaptadora GRB2 desempenhando um papel significativo nesse contexto. A GRB2 é composta por três domínios, sendo um domínio SH2 flanqueado por dois domínios SH3 (N- e C-terminal). Embora as funções citoplasmáticas da GRB2 sejam bem conhecidas, uma nova função foi recentemente observada em vias de reparo de DNA. O reparo de quebras na fita dupla do DNA é iniciado pela proteína MRE11, direcionando a recombinação por homologia. Nesse processo, a proteína GRB2 atua como intermediária na interação entre o DNA e a MRE11, utilizando seu domínio SH2, ou seja, a proteína GRB2, através de se domínio SH2, reconhece a proteína MRE11 e a conduz para a região do DNA danificado e assim, então, iniciar a via de reparo. No entanto, até o momento, não houve investigações moleculares abordando essa interação. Com o objetivo de compreender a interação entre o domínio SH2 e o peptídeo MRE11, assim como possíveis interações com outras proteínas parceiras, foram conduzidos experimentos de 15N-HSQC-NMR. Durante a titulação entre o domínio SH2 e o peptídeo MRE11-pY, foram observadas consideráveis mudanças nos CSP dos resíduos de aminoácidos, especialmente no sítio de interação I, apresentando uma conformação inédita na literatura. Apesar de desafios de solubilidade, as análises de interação entre GRB2-SH2 e MRE11-22 indicaram uma interação significativa, conforme evidenciado por um CSP global. Experimentos de dinâmica molecular revelaram uma similaridade na forma de interação entre os peptídeos MRE11-pY e o MRE11-22. Tentativas de interação com um peptídeo curto não fosforilado, MRE11-07, não obtiveram sucesso. Experimentos adicionais com um peptídeo hipotético, MRE11-7Y, corroboraram os resultados obtidos para os peptídeos derivados de MRE11. Por fim, nas titulações entre GRB2-SH2 e peptídeos derivados da histona H2AX (H2AX-pSpY e H2AX-pS), não foram observadas perturbações químicas, indicando ausência de interação. No entanto, o peptídeo H2AX-pY demonstrou interação, sugerindo que a presença de uma fosfotirosina é crucial para a interação, enquanto a adição de uma fosfoserina impede tal interação. Esses resultados sugerem novas perspectivas para as funções da GRB2 em vias biológicas.

Cells are subject to regulatory processes associated with survival, growth, differentiation, and apoptosis. During the cell proliferation cycle, potential failures can result in uncontrolled cell growth, leading to tumor development. The MAPK signaling pathway is one of the pathways impacted by these alterations, with the adaptor protein GRB2 playing a significant role in this context. GRB2 is composed of three domains, with an SH2 domain flanked by two SH3 domains (N- and C-terminal). Although the cytoplasmic functions of GRB2 are well-known, a new function has recently been observed in DNA repair pathways. Repair of double-strand DNA breaks is initiated by the protein MRE11, directing homology recombination. In this process, the GRB2 protein acts as an intermediary in the interaction between DNA and MRE11, utilizing its SH2 domain. Specifically, the GRB2 protein, through its SH2 domain, recognizes the MRE11 protein and guides it to the region of damaged DNA to initiate the repair pathway. However, to date, there have been no molecular investigations addressing this interaction. To understand the interaction between the SH2 domain and the MRE11 peptide, as well as possible interactions with other partner proteins, 15N-HSQC-NMR experiments were conducted. During the titration between the SH2 domain and the MRE11-pY peptide, considerable changes in chemical shift perturbations of amino acid residues were observed, especially at interaction site I, presenting a novel conformation in the literature. Despite solubility challenges, interaction analyses between GRB2-SH2 and MRE11-22 indicated significant interaction, as evidenced by a global CSP. Molecular dynamics experiments revealed similarity in the interaction mode between MRE11-pY peptides and MRE11-22. Attempts to interact with a short unphosphorylated peptide, MRE11-07, were unsuccessful. Additional experiments with a hypothetical peptide, MRE11-7Y, corroborated the results obtained for peptides derived from MRE11. Lastly, in titrations between GRB2-SH2 and peptides derived from histone H2AX (H2AX-pSpY and H2AX-pS), no chemical shift perturbations were observed, indicating no interaction. However, the H2AX-pY peptide demonstrated interaction, suggesting that the presence of a phosphotyrosine is crucial for the interaction, while the addition of a phosphoserine impedes such interaction. These results suggest new perspectives for the functions of GRB2 in biological pathways.
Dual approach in investigating the GRB2 protein: exploration of specific Interaction and dynamic folding analysis
Keywords: Growth Factor Receptor-Bound protein 2; Src Homology 2; Meiotic Recombination 11 homolog; H2AX; Ressonância Magnética Nuclear; Nuclear Magnetic Resonance