Caracterização genômica, transcriptômica e infecção em diferentes modelos de Salmonella Typhimurium invasiva não-tifoidal (iNTS) - Martins, Isabela Mancini [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A compreensão dos mecanismos pelos quais as bactérias intestinais se relacionam em comunidades complexas e com o hospedeiro são essenciais para o desenvolvimento de novas terapias. Estudos anteriores do grupo revelaram mecanismos de sinalização química relacionados à patogenicidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium que causam predominantemente gastroenterite em humanos no mundo todo. Porém, estudos recentes têm demonstrado que linhagens ST313 de S. Typhimurium são capazes de evadir do Trato Gastrointestinal (TGI) e atingir a corrente sanguínea de humanos com comorbidades por via de mecanismos ainda desconhecidos. Tais linhagens são denominadas invasive non typhoidal Salmonella (iNTS) e são descritas principalmente na África-subsaariana e no Brasil. O objetivo do presente trabalho foi auxiliar na compreensão da sobrevivência e colonização extra intestinal de linhagens de S. Typhimurium ST313. Foram utilizadas 13 linhagens de S. Typhimurium ST313 isoladas de hemoculturas humanas do Hospital Universitário da UNESP de Botucatu – SP entre os anos 1998-2011. O sequenciamento do genoma completo foi realizado para todas as linhagens pelo HiSeq e genes plasmidiais de virulência (pSLT) importantes para sobrevivência e multiplicação no hospedeiro e de resistência relacionados à produção de bombas de efluxo foram detectados na maioria das linhagens estudadas. Fenotipicamente foram observadas resistência apenas aos antimicrobianos estreptomocina, ampicilina e canamicina. A análise transcriptômica (RNA seq) de uma linhagem de S. Typhimurium ST313 cultivada em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com sangue de carneiro a 37ºC evidenciou o aumento na expressão de genes relacionados ao metabolismo lipídico (oxidação de lipídeos) na linhagem invasiva, desempenhando um papel importante durante a infecção crônica e colonização tecidual. O gene fadA é necessário para oxidação do ácido graxo e o gene citX no metabolismo e transporte lipídico, ambos apresentaram aumento de expressão e até o dado momento essa via ainda não foi explorada em ST313. Foram realizados nocautes gênicos via Lambda Red para caracterização fenotípica e ensaios in vitro e in vivo para avaliar a patogênese de S. Typhimurium ST313. A interrupção dos genes alvos fadA e citX resultaram na diminuição da invasão em células HeLa e diminuição da replicação/sobrevivências em macrófagos J774. No ensaio in vivo no modelo alternativo de Galleria mellonella a porcentagem de larvas sobreviventes é superior as larvas inoculadas com linhagens mutantes durante o período de 72 horas, evidenciando a atenuação da virulência de S. Typhimurium ST313 em genes correlacionados ao metabolismo lipídico, também foi visualizado na análise histopatológica atenuação das lesões no tecido intestinal dos mutantes em comparação a linhagem selvagem. Portanto, os resultados obtidos até o momento contribuem para uma melhor caracterização da virulência deste tipo clonal e entendimento deste importante patógeno em nosso meio.

Understanding the mechanisms by which intestinal bacteria interact in complex communities and with the host is essential for the development of new therapies. Previous studies by the group revealed chemical signaling mechanisms related to the pathogenicity of Salmonella enterica serovar Typhimurium that predominantly cause gastroenteritis in humans worldwide. However, recent studies have demonstrated that ST313 strains of S. Typhimurium are able to evade the Gastrointestinal Tract (GT) and reach the bloodstream of humans with comorbidities through mechanisms still unknown. These strains are known as invasive non-typhoidal Salmonella (iNTS) and are mainly described in sub-Saharan Africa and Brazil. The aim of the study was to help in understanding the survival and extra intestinal colonization of S. Typhimurium ST313 strains. We used 13 strains of S. Typhimurium ST313 isolated from human blood cultures at the University Hospital of UNESP in Botucatu – SP between the years 1998-2011. Whole genome sequencing was performed for all strains by HiSeq and plasmid virulence (pSLT) important for survival and multiplication in the host and resistance genes related to efflux pump production were detected in most of the strains studied. Phenotypically, resistance was observed only to the antimicrobials streptomocin, ampicillin and kanamycin. Transcriptomic analysis (RNA-seq) of a strain of S. Typhimurium ST313 grown in Luria-Bertani (LB) medium supplemented with sheep blood at 37ºC showed an increase in the expression of genes related to lipid metabolism (lipid oxidation) in the invasive strain, playing an important role during chronic infection and tissue colonization. The fadA gene is necessary for fatty acid oxidation and the citX gene for lipid metabolism and transport, both showed increased expression and so far this pathway has not been explored in ST313. Gene knockouts were generated via Lambda Red, and it was used to perform phenotypic characterization and in vivo and in vitro assays to evaluate the pathogenesis of S. Typhimurium ST313. Disruption of fadA and citX target genes resulted in decreased invasion in HeLa cells and decreased replication/survival in J774 macrophages. In the in vivo assay in the alternative model of Galleria mellonella, the percentage of surviving larvae is higher in larvae inoculated with mutant strains during the 72 hours period, evidencing the attenuation of virulence of S. Typhimurium ST313 in genes correlated to lipid metabolism, was also visualized in the histopathological analysis attenuation of the lesions in the intestinal tissue of the mutants in comparison to the wild lineage. Therefore, the results obtained so far contribute to a better characterization of the virulence of this clonal type and understanding of this important pathogen in our environment.
Genomic, transcriptomic and infection characterization in different models of invasive non-typhoidal Salmonella Typhimurium (iNTS)
Keywords: S. Typhimurium ST313; testes fenotípicos relacionados à virulência; transcriptoma; Galleria mellonella; phenotypic tests related to virulence; transcriptomic analysis