Análise exploratória em larga escala de microRNAs expressos em tilápia do Nilo utilizando ferramentas de bioinformática - Bovolenta, Luiz Augusto [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2016)
MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que regulam pós-transcricionalmente a expressão de genes, modelando o transcriptoma e a produção de proteínas. Em geral, os miRNAs são conservados no genoma de eucariotos, sendo considerados elementos vitais em diversos processos biológicos durante o desenvolvimento, tais como crescimento, diferenciação e morte celular. A grande diversidade de miRNAs identificados está restrita a poucas espécies e apenas uma parte do total de alvos de miRNAs preditos foi caracterizada funcionalmente. Nesse contexto, o uso da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento (high throughput sequencing) atrelada à análise de nível transcricional por RT-qPCR possibilitam a identificação do microRNoma. A tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus, é considerada um excelente modelo biológico para o estudo de miRNAs em vertebrados devido à sua importância econômica e evolutiva. O presente trabalho teve como objetivos: organizar os dados do sequenciamento dos miRNAs da tilapia do Nilo; disponibilizá-los em forma de uma base de dados para a comunidade científica; integrar as informações dos miRNAs identificados com outros bancos de dados de miRNAs; analisar os dados através de análises de bioinformática para determinação de agrupamentos definidos pelo nível de expressão de cada miRNA em seis tipos de tecido (músculo branco, músculo vermelho, testículo, ovário, fígado, olho, cérebro e coração) com distinção entre os gêneros e nas fases do desenvolvimento (2, 3, 4, 5 e 10 dias pós-fertilização), com a finalidade de criar hipóteses funcionais sobre os miRNAs; predizer os RNAs mensageiros alvos desses miRNAs identificados e, por fim, determinar a disposição dos miRNAs conhecidos nos 22 Linkage groups da tilápia com propósito de desenvolver mapas de localização. Foram identificados 271 pré-miRNAs conservados e 97 novos pré-miRNAs, e seus perfis de expressão com distinção das moléculas maduras dos miRNAs 5’ e 3’. Destaca-se com a maior diversidade e expressão elevada e dispersa, as amostras de estágios de desenvolvimento, especificamente a amostra do 5o dia pós-fertilização, o que demonstra a importância dos miRNAs no controle ontogênico da espécie e associações com o processo evolutivo. Além disso, se destaca a identificação de eventos de diversificação e troca da expressão entre as moléculas maduras 5’ e 3’ dos miRNAs entre as amostras, conhecidos como eventos de arm-switching, e a identificação da variabilidade das sequências maduras dos miRNAs, conhecidas como isomiRs, o que atribui um nível a mais para complexidade regulatória dos papéis funcionais dos miRNAs. Entre os eventos de arm-switching identificados é citado o mir-145, com evento associado à expressão em gônadas de gêneros distintos. E entre os isomiRs, se destaca os padrões tecido-específicos entre isomiRs de troca de bases nucléicas. Por fim para facilitar o acesso aos dados e resultados obtidos por esse trabalho e, permitir a reprodutibilidade das análises e avanço na pesquisa de miRNAs em eucariotos, os dados são disponibilizados em um banco de dados, o miRTil database (<http://www.lbbc.ibb.unesp.br/mirtil>).

MicroRNAs (miRNAs) are small RNA molecules that post-transcriptionally regulate the expression of genes, shaping the transcriptome and protein production. In general, miRNAs are highly conserved in the genome of eukaryotes and considered important elements in many biological processes during development, such as cell growth, differentiation and death. The large diversity of miRNAs identified is restricted to a few species and only a fraction of the predicted miRNAs targets has been functionally characterized. The use of high throughput sequencing technology coupled with gene expression analysis by RT-qPCR enable the characterization of the microRNome. The Nile tilapia, Oreochromis niloticus, can be considered an excellent biological model for miRNAs investigation in vertebrates due to its economic and evolutionary importance. To produce a functional annotation of the tilapia microRNome, this work organized the sequence data of expressed miRNAs, developed an open-access database of Nile tilapia miRNAs, integrated information of this database with other relevant databases, created hypotheses about physiologically relevant actions of these miRNAs by analyzing the miRNAs clusters induced by their similar expression profiles in six types of tissue (white muscle, red muscle, testis, ovary, liver, eye, brain and heart) and different stages of development (2, 3, 4, 5 and 10 days post-fertilization), predicted the miRNAs targets, and finally, determined the chromosomal location of expressed miRNAs on the 22 linkage groups of tilapia in order to build genomic maps of microRNA genes. We identified 271 conserved and 97 novel pre-miRNAs together with its expression profiles. Specifically, the expression values were distinguished into the 5’ and 3’ mature miRNA. We measured miRNA expression diversity along development. The highest diversity was observed at the sample of 5o day post-fertilization, which shows the importance of miRNAs in the species ontogenetic control. We also made associations between miRNA regulatory role in the ontogenic period and the evolutionary scenario. Moreover, this work highlights the diversification and exchange of expression in the mature molecule the 5’ to 3’ of miRNAs among samples, called arm-switching event, the variability of the mature sequences of miRNAs known as isomiRs, what characterizes a new regulatory complexity of the miRNA functional roles. Among the identified arm-switching events, we highlighted the mir-145 arm-switch associated with sex-biased expression in gonads. Among isomiRs, we highlighted the tissue-specific patterns of isomiRs with exchange of nucleic bases. Finally, we created the mirTil database (<http://www.lbbc.ibb.unesp.br/mirtil>), an open access database that guarantees the reproducibility of these analyses that could be also used on the investigation of other eukaryotes.
Large scale exploratory analysis of Nile tilapia's miRNA expression using bioinformatics tools
Keywords: Oreochromis niloticus; RNA-Seq; Pequenos RNAs não-codificantes; MicroRNAs; Regulação pós-transcricional; Small non-coding RNAs; Post-transcriptional gene regulation