Assessment of tolerance to inhibitors derived from plant biomass hydrolysis and xylose consumption by yeasts isolated from the environment - Zaiter, Mohammed Anas [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
A tendência por esgotamento das reservas de petróleo e os problemas ambientais decorrentes do uso de combustíveis de origem fóssil têm evidenciado a necessidade por fontes alternativas de energia sustentáveis e baratas. Isso impulsionou o uso de etanol como combustível líquido, especialmente em países como EUA e Brasil. Contudo, para suprir esta crescente demanda por combustíveis, no Brasil extensas áreas de terras são ocupadas por cana-de-açúcar, e têm competido com outras culturas vegetais, especialmente para suprimento da cadeia de alimentos. Como alternativa, nos últimos anos têm se intensificado estudos para produção de etanol a partir da biomassa vegetal residual, como bagaço de cana-de-açúcar e outros subprodutos da agroindústria, uma vez que este material é subaproveitado e rico em hexoses (C6) e pentoses (C5). Para que a hidrólise enzimática da biomassa vegetal resulte em açúcares fermentescíveis, são necessárias etapas de pré-tratamento deste material, os quais tendem a gerar compostos inibidores de crescimento microbiano. Desta forma, leveduras resistentes a estes inibidores e capazes de co-fermentar açúcares C5 e C6 são amplamente investigadas. Diferentemente da levedura Saccharomyces cerevisae, algumas espécies não-Saccharomyces têm se mostrado capazes de assimilar pentoses, mas ainda são muito pouco exploradas, frente a diversidade de espécies na natureza. Investigar leveduras fermentadoras de xilose, assim como suas tolerâncias a inibidores do crescimento microbiano, pode suportar futuros estudos de engenharia metabólica para capacitação da linhagem industrial S. cerevisiae. Portanto, este trabalho propôs-se a avaliar a capacidade das leveduras Pichia ofunaensis e Trichosporon multisporum para assimilar xilose, e suas tolerâncias a alguns compostos inibitórios, bem como suas capacidades para produção de etanol a partir de xilose. As leveduras foram cultivadas em meio YEPX, pH 4,5 contendo, separadamente, os inibidores hidroximetilfurfural (HMF), furfural, ácido ferúlico, ácido acético, ácido fórmico e vanilina, cultivadas a 28 ºC e 150 rpm por 96 h. A levedura P. ofunaensis apresentou crescimento em todas as concentrações destes inibidores e foi capaz de consumir completamente a xilose presente nos meios de cultivo, exceto em 20 mM de furfural, onde houve consumo de 40% da xilose, e entre 80 a 90% em maiores concentrações de ácido ferúlico (3 mM), ácido fórmico (40 mM) e vanilina (10 mM). Em presença de ácido acético 80 mM, a levedura não cresceu, e nas concentrações de 60 mM e 40 mM consumiu 20% e 90% da xilose presente nos meios, respectivamente. A levedura T. multisporum, em presença de furfural, exibiu crescimento até 15 mM e consumiu 30% da xilose. Em meio com ácido ferúlico, HMF e ácido fórmico, houve crescimento em todas as concentrações e consumo de até 40% (ácido ferúlico e HMF) e 30% (ácido fórmico) da xilose. Com vanilina, observamos crescimento até 5 mM deste inibidor e máximo consumo de 30% da xilose, e em meio contendo ácido acético a levedura não apresentou crescimento a 20 mM, exibindo consumo de até 40% de xilose em concentrações inferiores. A levedura P. ofunaensis se mostrou mais tolerante aos compostos considerados potencialmente tóxicos, exibindo melhor crescimento e consumo de xilose em comparação a levedura T. multisporum. Furfural e ácido acético se mostraram os compostos mais prejudiciais ao crescimento das leveduras. Por fim, na fermentação alcoólica, detectamos a produção de etanol apenas no cultivo da levedura P. ofunaensis, com máxima produção de 0,51 g/L após 96 h de cultivo em meio salino contendo 50 g/L de xilose.

Oil reserves are being depleted at an alarming rate, while the environmental problems arising from fossil fuels usage have highlighted the need for sustainable and cheap alternative energy sources, which has boosted the use of ethanol as a liquid fuel, especially in countries like the USA and Brazil. However, to meet this growing demand for combustibles, extensive land areas in Brazil have been occupied by sugarcane and have competed with other vegetable crops, especially for supplying the food chain. Alternatively, in recent years, studies have been intensified for ethanol production from residual plant biomass, such as sugarcane bagasse and other agro-industrial residues, since this material is underutilized and rich in hexoses (C6) and pentoses (C5). For enzymatic action in the degradation of plant biomass, resulting in fermentable sugars, pre-treatment steps of this material are necessary, which tend to generate compounds that inhibit microbial growth. Thus, yeast resistance to these inhibitors and the capability of co-fermenting C5 and C6 sugars are widely investigated. Unlike the yeast Saccharomyces cerevisiae, some non-Saccharomyces species can assimilate pentoses, but they are still very little explored, given the diversity of species in nature. Investigating xylosefermenting yeasts, as well as their tolerances to microbial growth inhibitors, may support future studies of metabolic engineering to enable the industrial strain S. cerevisiae. Therefore, this work aimed to evaluate the capacity of Pichia ofunaensis and Trichosporon multisporum yeasts to assimilate xylose and their tolerances to some inhibitory compounds, as well as their capability to produce ethanol from xylose. Yeasts were cultivated in YEPX medium, pH 4.5, containing, separately, the inhibitors hydroxymethylfurfural (HMF), furfural, ferulic acid, acetic acid, formic acid, and vanillin, cultivated at 28 ºC and 150 rpm for 96 h. The yeast P. ofunaensis grew at all concentrations of these inhibitors and was able to completely consume the xylose present in culture media, except in 20 mM furfural, in which 40% of xylose was consumed, and between 80 and 90 % in higher concentrations of ferulic acid (3 mM), formic acid (40 mmM), and vanillin (10 mM). In the presence of 80 mM acetic acid, the yeast did not grow, and at the concentrations of 60 mM and 40 mM, it consumed 20% and 90% of the xylose present in the media, respectively. The yeast T. multisporum, in the presence of furfural, exhibited growth up to 15 mM and consumed 30% of the xylose. In media with ferulic acid, HMF, and formic acid, there was growth at all concentrations and consumption of up to 40% (ferulic acid and HMF) and 30% (formic acid) of xylose. With vanillin, we observed growth up to 5 mM of this inhibitor and maximum consumption of 30% of xylose, and in a medium containing acetic acid the yeast did not grow at 20 mM, exhibiting consumption of up to 40% of xylose at lower concentrations. The yeast P. ofunaensis was more tolerant to compounds considered potentially toxic and showed better growth rates and xylose consumption compared to the yeast T. multisporum. Furfural and acetic acid proved to be the most harmful compounds for yeasts growth. Finally, in the alcoholic fermentation, we detected ethanol production only in the yeast P. ofunaensis cultures, with a maximum output of 0.51 g/L after 96 h of cultivation in a saline medium containing 50 g/L of xylose.
Avaliação da tolerância a inibidores derivados de hidrólise de biomassa vegetal e consumo de xilose por leveduras isoladas do ambiente
Keywords: Biomassa lignocelulósica; Bioetanol; Ácidos orgânicos; Fermentação; Leveduras; Pentose; Xilose; Bioethanol; Fermentation; Lignocellulosic biomass; Organic acids; Pentose; Yeasts; Xylose