Avaliação do sêmen refrigerado com ou sem plasma seminal e sua correlação com as proteínas do ejaculado de diferentes raças caninas - Araujo, Michelle Silva [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
O plasma seminal e suas proteínas influenciam a qualidade espermática do sêmen refrigerado e congelado em várias espécies, porém sua influência no sêmen refrigerado de cães ainda não está esclarecida. Ainda, diferenças interraciais na expressão de proteínas do plasma seminal que podem interferir na qualidade do sêmen canino não foram relatadas. O objetivo deste estudo foi verificar se a raça canina interfere na composição proteica do plasma seminal e das proteínas espermáticas e correlacioná-las com a refrigeração do sêmen canino na presença e ausência do plasma seminal. Desta maneira, dois experimentos foram realizados. No primeiro experimento as proteínas do plasma seminal e das células espermáticas de 4 raças caninas foram caracterizadas. O sêmen foi colhido, avaliado macro e microscopicamente. O plasma seminal e as células espermáticas foram separadas por centrifugação, refrigerados a 5 ºC e transportados ao laboratório para análise proteômica. Proteínas do plasma seminal e das células espermáticas foram digeridas, submetidas à espectrometria de massas, identificadas e caracterizadas quanto à ontologia gênica. A relação entre as proteínas encontradas e as raças caninas foi avaliada por análise multivariada. Foram encontradas 10 proteínas no plasma seminal e cinco proteínas espermáticas consideradas relevantes. Notou-se diferença na expressão de proteínas espermáticas e do plasma seminal de diferentes raças caninas. Para o segundo experimento, 3 pools do ejaculado de 8 cães, provenientes do experimento 1 foram utilizados. A morfologia, motilidade espermática computadorizada (CASA), espermatozoides íntegros e lesados (eosina / nigrosina), integridade de membranas plasmática e do acrossomo, produção de superóxido, produção de peróxido de hidrogênio, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica, produção de espécies reativas ao oxigênio (técnica do ácido tiobarbitúrico induzido e espontâneo) e produção de enzimas antioxidantes (ELISA) foram avaliadas a cada 48 e 72 horas (M0, M48, M96 e M168) durante 168 horas (7 dias), em amostras de sêmen canino refrigeradas a 5 ºC com e sem plasma seminal. As amostras seminais foram divididas em dois grupos: sêmen diluído em TRIS-gema-glicose com plasma seminal e sêmen diluído em TRIS-gema glicose sem plasma seminal. Os dados obtidos foram analisados pelo two-way ANOVA e a análise multivariada pelo teste de Bonferroni. As amostras refrigeradas com plasma seminal apresentaram maior motilidade total, motilidade progressiva, velocidade média do trajeto, velocidade em linha reta, espermatozoides rápidos, índice de movimento espermático, espermatozoides com membranas plasmática e do acrossomo íntegras, maior potencial mitocondrial, menor movimento lateral de cabeça e menos espermatozoides médios e lentos. Com relação ao tempo de refrigeração, foi observada diferença estatística para a motilidade total, velocidade em linha reta, movimento lateral de cabeça, movimento retilíneo, linearidade, coeficiente de oscilação e índice de movimento. O perfil proteômico das proteínas espermáticas e do plasma seminal de quatro raças caninas foi descrito. Foi observada similaridade no padrão de expressão de proteínas espermáticas entre as raças Golden Retriever e Pastor de Maremmano Abruzzese, e entre as raças Dogue Alemão e Bernese. As raças Pastor de Maremmano Abruzzese, Dogue Alemão e Bernese apresentaram similaridade no padrão de expressão das proteínas do plasma seminal. O plasma seminal exerceu influência positiva sobre os parâmetros de motilidade e viabilidade espermática e função mitocondrial durante a refrigeração do sêmen a 5 ºC.

Seminal plasma and its proteins influence the sperm quality of chilled and frozen semen in several species, but its influence on the cooled semen of dogs has not yet been clarified. Furthermore, interracial differences in the expression of seminal plasma proteins that may interfere with the quality of canine semen have not been reported. The objective of this study was to verify if the racial pattern interferes in the protein composition of seminal plasma and sperm proteins and to correlate them with the cooling of canine semen in the presence and absence of seminal plasma. In this way, two experiments were performed. In the first experiment the seminal plasma proteins of 5 canine breeds and sperm proteins of 4 breeds were characterized. The semen was collected, evaluated macro and microscopically. Seminal plasma and sperm cells were separated by centrifugation, refrigerated at 5° C and transported to the laboratory for proteomic analysis. Seminal plasma and spermatozoa proteins were digested, submitted to mass spectrometry, identified and characterized for gene ontology. The relationship between the proteins found and the canine breeds was evaluated by multivariate analysis. In the seminal plasma, 10 relevant proteins were found and in the spermatozoa five proteins were considered relevant. Differences were observed in the expression of sperm proteins from different canine breeds. For the second experiment, 3 ejaculate pools of 8 dogs from experiment 1 were used. The morphology, computer-assisted sperm motility (CASA), intact and damaged spermatozoa (eosin / nigrosin), plasma and acrosome membrane integrity, superoxide production, hydrogen peroxide production, mitochondrial potential, lipid peroxidation, oxygen reactive species production (induced and spontaneous thiobarbituric acid technique) and antioxidant enzyme production (ELISA) were evaluated every 48 and 72 hours (M0, M48, M96 and M168) until 168 hours (7 days) in samples of canine semen cooled at 5º C with and without seminal plasma. Seminal samples were divided into two groups, semen extended in TRIS-egg yolk-glucose with seminal plasma and semen extended in TRIS-egg yolk-glucose without seminal plasma. Data were analyzed by two-way ANOVA and multivariate analysis using the Bonferroni test. Seminal plasma refrigerated samples showed high total motility, progressive motility, mean velocity (VAP), straight velocity, rapid spermatozoa, movement index, plasma and acrosomal sperm membranes, greater mitochondrial potential, low lateral head movement and low medium and slow spermatozoa. According to refrigeration time, statistical was significant for total motility, straight velocity, lateral head movement, straightness coefficient, linearity, oscillation coefficient and movement index. The profile of seminal plasma and spermatozoa proteins from the ejaculate of four canine breeds were described. Similarities between Golden Retriever and Maremmano-Abruzzese Sheepdog; and between Great Dane and Bernese Mountain Dog in proteomic profile of spermatozoa exist; while MaremmanoAbruzzese Sheepdog, Gread Dane and Bernese were correlated in proteomic profile of seminal plasma. Seminal plasma exerted a positive influence on the parameters of motility and sperm viability and mitochondrial function during semen refrigeration at 5 ºC.
Evaluation of chilled semen with or without seminal plasma and its correlation with the ejaculate proteins of different canine breeds
Keywords: peroxidação lipídica; refrigeração; proteômica; sêmen; cães; lipidic peroxidation; cooling; proteomic; dogs