Proteínas de interação da EPPIN no espermatozoide de camundongos: identificação, expressão e potenciais papeis fisiológicos - Mariani, Noemia Aparecida Partelli [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
A EPPIN (do inglês, Epididymal peptidase inhibitor), proteína antimicrobiana rica em resíduos de cisteína contendo duas sequências consenso de domínios de inibidores de protease do tipo WFDC e Kunitz, é um alvo farmacológico para o desenvolvimento de novos contraceptivos masculinos devido ao seu papel crítico na motilidade do espermatozoide. O desenvolvimento de fármacos contraceptivos baseados nas funções da EPPIN requer um entendimento mais profundo a respeito dos seus mecanismos fisiológicos e posterior avaliação da eficácia e segurança da potencial droga em modelos pré-clínicos. No presente estudo, investigamos o perfil de expressão da EPPIN em tecidos e em espermatozoides testiculares e epididimários de camundongos e identificamos potenciais proteínas que interagem com a EPPIN no espermatozoide maduro. Para caracterizar o perfil de expressão da EPPIN, processamos órgãos reprodutivos e não-reprodutivos, além de espermatozoides para ensaios de RT-PCR, qPCR, Western blot e imuno-histoquímica/imunofluorescência. Para a identificação dos parceiros de ligação da EPPIN, coletamos espermatozoides do corpo/cauda do epidídimo e incubamos as células com a fração solúvel em tampão fosfato do fluído da glândula seminal dos mesmos animais. Realizamos ensaios de co-imunoprecipitação utilizando anticorpo anti-EPPIN Q20E ou IgG de coelho (controle negativo) para imunoprecipitar a EPPIN e co-imunoprecipitar suas proteínas parceiras, processamos as amostras para digestão de proteínas com tripsina e identificamos os peptídeos trípticos por espectrometria de massas (LC-MS/MS). Nossos resultados mostraram que a expressão da EPPIN (RNAm e proteína) é dependente do nível de andrógenos, abundantemente expressa no testículo e epidídimo, mas também presente no ducto deferente, glândula seminal e glândula adrenal de camundongos. Observamos também imunomarcação positiva para a EPPIN na região acrossômica e flagelo de espermatozoides epididimários, sugerindo potenciais ações na reação acrossômica e motilidade espermática. A co-imunoprecipitação com anticorpo anti-EPPIN e posterior análise por LC-MS/MS e Western blot utilizando espermatozoides epididimários maduros pré-incubados com fluído da glândula seminal revelou que as proteínas SVS2, SVS3a, SVS5 e SVS6 secretadas pela glândula seminal são potenciais proteínas de interação da EPPIN na superfície do espermatozoide. Realizamos ensaios de Western blot das amostras obtidas nos ensaios de co-imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-EPPIN, anti-SVS2 e anti-SVS3 para confirmação dos resultados e ensaios de Far-Western blot com as proteínas EPPIN e SVS2 recombinantes para investigar a potencial interação proteica. Esses dados sugerem que a EPPIN é uma proteína que atua em complexos proteicos na superfície do espermatozoide de camundongos. Nossos resultados fornecem novas informações sobre os papéis fisiológicos da EPPIN em machos e destacam sua importância para interações proteína-proteína no espermatozoide, as quais podem proteger e preparar o gameta masculino durante sua jornada pelo sistema reprodutor feminino e facilitar o processo de fertilização. Além disso, nossos dados sustentam a viabilidade do camundongo como modelo experimental adequado para estudar as funções e mecanismos fisiológicos da EPPIN, bem como para o avanço no seu desenvolvimento como alvo farmacológico para contracepção masculina.

EPPIN (Epididymal peptidase inhibitor), a cysteine-rich antimicrobial protein containing both Kunitz and whey acidic protein (WAP)-type four disulfide core protease inhibitor consensus sequences, is a target for the development of new male contraceptive drugs due to its critical role in sperm motility. The development of contraceptive drugs based on EPPIN functions requires a deeper understanding on its physiological roles and further evaluation of efficacy and safety of the potential drug with preclinical models. Herein, we investigated the expression profile of EPPIN in tissues and in spermatozoa from testis and epididymis and identified potential proteins that interact with EPPIN in mature sperm. To characterize the expression profile of EPPIN, we processed reproductive and non-reproductive organs, as well as spermatozoa for RT-PCR, qPCR, Western blot and immunohistochemistry/immunofluorescence assays. For the identification of potential EPPIN’s partners, we collected spermatozoa from the corpus/cauda epididymis and incubated them with the phosphate-soluble fraction of seminal vesicle fluid from the same animals. Then, we performed co-immunoprecipitation assays using anti-EPPIN Q20E antibody or rabbit IgG (negative control) to immunoprecipitate EPPIN and co-immunoprecipitate its partner proteins, processed samples for trypsin protein digestion and identified tryptic peptides by mass spectrometry (LC-MS/MS). Our results showed that the Eppin is an androgendependent gene, abundantly expressed in the testis and epididymis, but also present in the vas deferens, seminal vesicle and adrenal gland of mice. We observed EPPIN-positive immunostaining in the acrosomal region and flagellum of epididymal spermatozoa, suggesting potential actions of EPPIN in the acrosome reaction and sperm motility. Co-immunoprecipitation with anti-EPPIN antibody and analysis by LC-MS/MS and Western blot using mature epididymal spermatozoa pre-incubated with seminal vesicle fluid revealed that the SVS2, SVS3a, SVS5 and SVS6 are potential interaction proteins of EPPIN in the sperm surface. We performed Western blot assays of the samples obtained from co-immunoprecipitation assays using anti-EPPIN, anti- SVS2 and anti-SVS3 antibodies to confirm the co-immunoprecipitation of SVS2 and SVS3, and Far-Western blot assays with recombinant EPPIN and SVS2 to further investigate their interaction. Our data suggest that EPPIN is a protein that acts as a hub for the interaction of SVS proteins in mouse spermatozoa. In addition, our results provide new insights into the physiological roles of EPPIN in males and highlight its importance for protein-protein interactions in the spermatozoon, which can protect and prepare the male gamete during its journey through the female reproductive system and facilitate the fertilization process. Thus, our data provide support for the use of the mouse as an experimental model to study physiological functions and mechanisms of EPPIN, as well as its further development as a contraceptive drug target.
EPPIN interaction proteins in mouse sperm: identification, expression and potential physiological roles
Keywords: EPPIN; contraceptivos masculinos; espermatozoide; interações proteína-proteína