Isolamento e análise in silico de nova subclasse de parasporina do tipo 4 de Bacillus thuringiensis coreanensis e sua potencial aplicação biotecnológica - Santos, Thais Nayara Ferreira dos [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva que possui suas linhagens estudadas principalmente para o controle de insetos-praga. Porém, recentes estudos apontam a presença de outras proteínas sem ação inseticida conhecida. Essas proteínas denominadas “parasporinas” (PS) possuem atividade citotóxica e apresentam seis classes, sendo PS1, PS2, PS3, PS4, PS5 e PS6. Entre essas a PS4 apresenta somente uma subclasse descrita, presente na linhagem Bacillus thuringiensis shandongiensis. Dado ao pouco conhecimento sobre as ações das proteínas PS4 e a existência de somente uma subclasse descrita, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização da linhagem Bacillus thuringiensis coreanensis como potencial fonte da proteína PS4. A partir do DNA total extraído dessa linhagem, o gene ps4 foi isolado, clonado e análises in silico de sua sequência foram realizadas. Nessas análises foram utilizadas ferramentas como Bioedit, BLAST, Clustal Omega, Geneious, IQ-Tree e iTOL. Para a análise estrutural da PS4 encontrada, em comparação a PS4 do banco de dados (BAD22577), foram utilizadas as ferramentas Alphafold2, Pymol e InterPro. Análises em gel de SDS-PAGE permitiram a visualização da proteína PS4 de B.t. coreanensis inativa e ativa, após solubilização e ativação com Proteinase K. Foram efetuados bioensaios com o inseto-praga Spodoptera frugiperda utilizando cultura crescida das linhagens B.t. coreanensis, B.t. shandongiensis e B.t. kurstaki HD-73 para testar sua efetividade como linhagem inseticida. Foram também realizadas análises morfológicas das inclusões cristalinas dessas mesmas linhagens para visualização da diferença entre seus tipos de cristais em microscopia de varredura. A análise in silico da sequência obtida revelou similaridade de 92,03% com a sequências de ps4 presente no banco de dados (AB180980). Os bioensaios mostraram a atividade não inseticida da linhagem B.t. coreanensis frente ao inseto-praga, semelhante ao que ocorreu com B.t. shandongiensis, já caracterizado como portador da proteína PS4 e diferente da linhagem B.t. kurstaki, que apresentou um alto poder inseticida como previsto na literatura. Os estudos de modelagem das proteínas e a comparação de suas estruturas revelaram que a linhagem de B.t. coreanensis possui uma nova subclasse de PS4, denominada PS4Ab1, sendo importante fonte de parasporina a ser explorada em aplicações biotecnológicas.

Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive bacterium whose strains have been studied mainly for the control of insect pests. However, recent studies indicate the presence of other proteins with no known insecticidal action. These proteins called “parasporins” (PS) have cytotoxic activity and have six classes, namely PS1, PS2, PS3, PS4, PS5 and PS6. Among these, PS4 has only one described subclass, present in the Bacillus thuringiensis shandongiensis lineage. Given the limited knowledge about the actions of PS4 proteins and the existence of only one described subclass, the present work aimed to characterize the Bacillus thuringiensis coreanensis strain as a potential source of the PS4 protein. From the total DNA extracted from this strain, the ps4 gene was isolated, cloned and in silico analyzes of its sequence were performed. Tools such as Bioedit, BLAST, Clustal Omega, Geneious, IQ-Tree and iTOL were used in these analyses. For the structural analysis of the PS4 found, in comparison to the PS4 in the database (BAD22577), the tools Alphafold2, Pymol and InterPro were used. SDS-PAGE gel analyzes allowed the visualization of the PS4 inactive and active protein from B.t. coreanensis, after solubilization and activation with Proteinase K. Bioassays were carried out with the insect pest Spodoptera frugiperda using culture grown from B.t. coreanensis, B.t. shandongiensis and B.t. kurstaki HD-73 to test its effectiveness as an insecticidal strain. Morphological analyzes of the crystalline inclusions of these same strains were also carried out to visualize the difference between their types of crystals under scanning microscopy. In silico analysis of the obtained sequence revealed 92.03% similarity with the ps4 sequences present in the database (AB180980). Bioassays showed the non-insecticidal activity of the B.t. coreanensis against the insect pest, similar to what happened with B.t. shandongiensis, already characterized as carrying the PS4 protein and different from the B.t. kurstaki, which presented a high insecticidal power as predicted in the literature. Protein modeling studies and comparison of their structures revealed that the B.t. coreanensis has a new subclass of PS4, called PS4Ab1, which is an important source of parasporin to be explored in biotechnological applications.
Isolation and in silico analysis of a new subclass of parasporin type 4 from Bacillus thuringiensis coreanensis and its potential biotechnological application
Keywords: Câncer; Citotoxicidade; Bioinformática; Modelagem; Filogenética