Avaliação do efeito imunomodulador de um oligonucleotídeo anti-CTLA-4 em formulação com um candidato vacinal recombinante contra a esporotricose - Momente, Giovanna Justino [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
Introdução: A esporotricose é endêmica na América Latina e se apresenta como zoonose transmitida por gatos infectados pelo fungo Sporothrix brasiliensis. As células T CD4+ regulatórias, que expressam as moléculas CD25, FOXP3 e CTLA-4, são responsáveis pela eficácia dos mecanismos de autotolerância e regulação da resposta imune estimuladas por formulações vacinais. Estudos demonstram que a estratégia de bloqueio das moléculas FOXP3 e CTLA-4 melhoram a imunogenicidade das vacinas, como, por exemplo, com o uso dos oligonucleotídeos antisentido (ASOs) que se ligam de maneira complementar ao RNA mensageiro alvo, estimulando o bloqueio da tradução desse gene e da expressão proteica. Objetivos: Avaliar se um ASO anti-CTLA-4 potencializa as propriedades imunogênicas de uma formulação baseada na enolase recombinante de Sporothrix spp (rSsEno) e no adjuvante imunológico Gel01. Metodologia: Células de Escherichia coli, transformadas com o plasmídeo recombinante pET28a::SsEno, foram induzidas na presença de Isopropilβ-d-1-tiogalactopiranosídeo 0,2mM por 4h a 30°C. O “pellet” induzido foi lisado, centrifugado, a proteína rSsEno contida no sobrenadante foi purificada por cromatografia de afinidade ao níquel e sua concentração protéica estimada pelo ensaio do ácido bicinconínico. A eficiência do processo de indução e purificação da rSsEno foi avaliada por SDS-PAGE a 12%. Camundongos BALB/c receberam três doses por via subcutânea das formulações: PBS, rSsEno, Gel01+rSsEno e Gel01+rSsEno+ASO anti-CTLA-4. Os níveis de anticorpos IgG e IgG2b específicos no soro de animais imunizados foram determinados por ELISA. Esplenócitos de cada grupo foram estimulados in vitro com rSsEno e a fenotipagem de células CD4+CTLA-4+ e citocinas do padrão de resposta Th1/Th2/Th17 foram determinadas por citometria de fluxo. Resultados e Discussão: O SDS-PAGE indicou que a proteína induzida foi obtida com alto grau de pureza, sendo sua concentração de 15,719 mg/L. Após a imunização, a resposta de anticorpos IgG e IgG2b foi superior (p>0,05) no grupo imunizado com a formulação ASO anti-CTLA-4 em comparação aos demais grupos experimentais. Nesse grupo, a porcentagem de células CD3+CD4+CTLA-4+ foi inferior em relação aos outros grupos, o que evidencia que o ASO diminuiu a expressão de CTLA-4. Também nesse grupo de camundongos houve a maior produção de IL-2 e IFN-γ, evidenciando o efeito imunoestimulador do ASO anti-CTLA-4. Conclusão: O ASO anti-CTLA-4 aumentou significativamente as propriedades imunogênicas do candidato vacinal baseado na proteína rSsEno, mostrando potencial de ser utilizado como imunoadjuvante em formulações vacinais contra a esporotricose.

Introduction: Sporotrichosis is endemic in Latin America and presents as a zoonosis transmitted by cats infected by the fungus Sporothrix brasiliensis. Regulatory CD4+ T cells, which express the CD25, FOXP3, and CTLA-4 molecules, are responsible for the efficacy of self-tolerance mechanisms and immune response regulation stimulated by vaccine formulations. Studies have shown that the blocking strategy of the FOXP3 and CTLA-4 molecules improves the immunogenicity of vaccines, such as with the use of ASOs that bind in a complementary way to the target messenger RNA, stimulating the blockade of the translation of this gene and protein expression. Objectives: To evaluate whether an anti-CTLA-4 ASO potentiates the immunogenic properties of a formulation based on the recombinant enolase of Sporothrix spp (rSsEno) and the adjuvant Gel01. Methodology: Escherichia coli cells transformed with the recombinant plasmid pET28a::SsEno, were induced in the presence of Isopropylβ-D-1-tiogalactopyranoside 0.2mM for 4h at 30°C. The induced “pellet” was lysed, centrifuged and the rSsEno protein contained in the supernatant was purified by nickel affinity chromatography and its protein concentration estimated by the bicinconinic acid assay. The efficiency of the rSsEno induction and purification process was evaluated by SDS-PAGE at 12%. BALB/c mice received three subcutaneous doses of the formulations: PBS, rSsEno, Gel01+rSsEno and Gel01+rSsEno+ASO anti-CTLA-4. The levels of specific IgG and IgG2b antibodies in the serum of immunized animals were determined by ELISA. Splenocytes from each group were activated in vitro with rSsEno and the phenotyping of CD3+CD4+CTLA-4+ cells and cytokines of the Th1/Th2/Th17 response pattern were determined by flow cytometry. Results and Discussion: The SDS-PAGE indicated that the induced protein was obtained with a high degree of purity, with a concentration of 15,719 mg/L. After immunization, the response of IgG and IgG2b antibodies was higher (p>0.05) in the group immunized with the ASO anti-CTLA-4 formulation compared to the other experimental groups. In this group, the percentage of CD4+CTLA-4+ cells was lower than in the other groups, which shows that ASO decreased CTLA-4 expression. Also in this group of mice there was the highest production of IL-2 and IFN-γ, evidencing the immunostimulatory effect of ASO anti-CTLA-4. Conclusion: The ASO anti-CTLA-4 significantly increased the immunogenic properties of the vaccine candidate based on the rSsEno protein, showing potential to be used as an immunoadjuvant in vaccine formulations against sporotrichosis.
Evaluation of the immunomodulatory effect of an anti-CTLA-4 oligonucleotide formulated with a recombinant vaccine candidate against sporotrichosis
Keywords: esporotricose; vacinas; oligonucleotídeo; imunologia; rSsEno; CTLA-4