Diversidade de microrganismos endofíticos associados a folhas de oliveiras e sua relação anti-herbivoria por formigas-cortadeiras - Oliveira, Amanda Aparecida de [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020)
Nas últimas décadas no país, a olivicultura tem se expandido na região sudeste principalmente nos estados como São Paulo e Minas Gerais, desafios com insetos pragas como as formigas-cortadeiras têm se mostrado um obstáculo para o cultivo. A oliveira (Olea europaea) é uma planta originária da região Mediterrânea e tem se mostrado altamente atrativa ao corte por formigas-cortadeiras, essa que por sua vez têm origem nos neotrópicos. Em busca de métodos de controles alternativo para formigas-cortadeiras, pesquisas com microrganismos para esse uso têm ganhado destaques nos últimos anos. Os microrganismos endofíticos são principalmente fungos e bactérias que vivem dentro do tecido foliar sem causar danos aparentes ao hospedeiro. Pesquisas sobre abundância de endófitos mostrou que esse parâmetro além de idade e tenacidade da folha deveriam ser considerados sobre escolha de corte. Para a cultura da oliveira não se sabe se cultivares diferentes influenciariam na escolha do corte das formigas-cortadeiras. Os endofíticos podem desempenhar inúmeros benefícios às plantas hospedeiras como promoção de crescimento, resistência a estresse abióticos e proteção anti-herbivoria. Por isso, conhecer a diversidade de microrganismos endofíticos associados a folhas de oliveiras é um primeiro passo para compreensão dessa interação entre as formigas-cortadeiras e essa planta introduzida. Ferramentas moleculares são frequentemente utilizadas para conhecer diversidade de endofíticos combinando técnicas de isolamento e de sequenciamento de nova geração (NGS). Assim, os objetivos deste estudo foram identificar a diversidade de microrganismos endofíticos associados às folhas de oliveira com métodos dependente e independente de cultura, verificar quais fatores influenciam a composição e abundância dessa comunidade microbiana, realizar isolamento de fungos endofíticos, identificá-los molecularmente, identificar o modo trófico desses fungos pelo FunGuild e verificar a preferência de corte das formigas-cortadeiras entre as cultivares de oliveiras. Amostras de folhas foram coletadas de 93 plantas em nove localidades dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Uma parte foi utilizada para extrair diretamente o DNA e a outra para realizar o isolamento dos fungos. Para o sequenciamento metabarcoding pelo equipamento MiSeq (Illumina) foram utilizados primers para as regiões 16S rRNA para identificar bactérias e ITS para fungos. Para os fungos cultiváveis utilizou-se sequenciamento Sanger da região ITS. Os resultados revelaram que fatores como idade, altitude e geografia podem influenciar a comunidade microbiana, enquanto que a cultivar não influenciou. Para a comunidade bacteriana endofítica o fator que influenciou foi a localização geográfica e para a comunidade fúngica foram idade, altitude e localização. Foram obtidos cerca de 800 isolados, que foram agrupados em 191 morfotipos e identificados molecularmente, resultando em 38 gêneros, sendo 32 deles registrados pela primeira vez em oliveiras cultivadas no Brasil. Entre os fungos cultiváveis o nível trófico mais abundante foi o patotrófico. As cultivares não influenciaram no corte pelas formigas-cortadeiras. Outros estudos serão necessários para melhor compreender como esses herbívoros apresentam uma capacidade de desfolhar plantas não-nativas como as oliveiras. Os isolados fúngicos obtidos serão utilizados para novas abordagens em diferentes áreas do conhecimento como fitopatologia e controle de insetos.

Brazil is the seventh-largest importer of olive oil and olives, in recent years olive growing has expanded in the southeast region of the country in states such as Sao Paulo and Minas Gerais precisely because it has excellent consume. However, there are some challenges in this culture and one of them is the insect pests such as leaf-cutter ants. The olive tree (Olea europaea) is a plant originating in the Mediterranean region that has been shown to be highly attractive to cutting by leaf-cutting ants, which originate in the Neotropics. Nowadays, the most efficient control method is toxic baits, but they are harmful to the environment and humans. Therefore, control alternatives are needed, in this line of research, microorganisms have gained prominence in recent years. Endophytic microorganisms are mainly fungi and bacteria that live inside the leaf tissue without causing apparent damage to the host. Research on endophyte abundance has shown that this parameter in addition to leaf age and tenacity should be considered on cut choice. For olive tree culture, it is not known if different cultivars would influence the choice by cutting ants. Endophytes can perform numerous benefits to host plants such as growth promotion, resistance to antibiotic stress, and anti-herbivory protection. Therefore, knowing the diversity of endophytic microorganisms associated with olive leaves is a first step in understanding the interaction between leaf-cutting ants and the introduced plant. Molecular approaches are often used to discover endophytic diversity combining isolation techniques and new generation sequencing (NGS). Thus, the objectives were to identify the diversity of endophytic microorganisms associated with olive leaves with culture dependent and independent methods, to verify which factors influence the composition and abundance of this microbial community, to isolate endophytic fungi, to identify them molecularly, to identify the trophic mode of these fungi by FunGuild and to test the cutting preference of ants between olive cultivars. Leaf samples were collected from 93 plants in nine locations in the states of São Paulo and Minas Gerais. The surfaces of the leaves were sterilized and one part was used to extract directly the DNA and the other to perform the isolation of the fungi. For the metabarcoding sequencing using Illumina MiSeq, primers for the 16S rRNA regions were used to identify bacteria and for the ITS region to identify fungi. Isolated fungi had their ITS region sequenced by the Sanger method. The results revealed that factors such as age, altitude, and geography could influence the microbial community, while cultivar was not influential. For the endophytic bacterial community, the most influential factor was geographic location and for the fungal community age, altitude, and location. About 800 isolates, were obtained, which were grouped into191 morphotypes and identified molecularly resulting in 38 genera, 32 of which were registered for the first time in olive trees cultivated in Brazil. Among the cultivable fungi, the most abundant trophic level was the pathotrophic. Cultivars, had no influence on cutting by the cutting ants. Further studies will be needed to better understand how these herbivores can defoliate non-native plants like olive trees. The obtained fungal isolates will be used for new approaches in different areas of knowledge such as phytopathology and insect control.
Diversity of endophytic microorganisms associated with olive leaves and their anti-herbivory relationship by leaf-cutting ants
Keywords: Herbivoria; Endofíticos; Formigas-cortadeiras; Diversidade; NGS; Leaf-cutting ants; Endophytic fungi; Endophytic bacteria; Herbivory; Diversity; Fungos endofíticos; Bactérias endofíticas