Clonagem, expressão e purificação de domínios da proteína AtRLI2 (RNase L Inhibitor), um supressor endógeno de silenciamento por RNA de Arabidopis thaliana, visando estudos estruturais - Souza, Edmárcia Elisa de [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2010)
A RNase L inhibitor (RLI) é uma proteína altamente conservada em Eukatyota e Archaea e foi primeiramente identificada em humanos, onde se mostrou reguladora da via 2'-5' - oligoadenilato sintetase/ribonuclease L (OAS/RNase L), principal via induzida por interferon. Novas funções têm sido descritas para RLI em diferentes organismos, dentre elas o controle do silenciamento por RNA e resistência a vírus. Visando futuros estudos estruturais foi possível subclonar a sequência que codifica para o domínio NBDs (Nucleotide Binding Domain) de AtRLI2 de Arabidopsis thaliana em vetor de expressão pET-28a(+) capaz de expressar a proteína NBDs ligada a um His6 tag. A proteína NBDs foi expressa e purificada por cromatografia de afinidade por níquel em condição nativa utilizando detergente N-lauril-sarcosil, com um rendimento da ordem de 8 mg/L e em condição desnaturante utilizando uréia, com um rendimento da ordem de 10 mg/L. Para renaturação da proteína utilizou-se dATP e cloreto de magnésio com posterior diálise obtendo-se uma diminuição significativa dos corpúsculos de inclusão e o aumento da solubilidade da proteína produzida em condição desnaturante. Para confirmar a presença dos resíduos His6 tag em fusão com a proteína NBDs, testes de Western blot foram realizados utilizando extrato total das células induzi das, a proteína purificada e a proteína originada da diálise. Foi possível concluir que houve o reconhecimento do anticorpo monoclonal anti-HiS6 tag à proteína confirmando o sucesso da obtenção e purificação da proteína fusionada à uma sequência de 6 histidinas. Etapas posteriores de purificação, a partir da proteína NBDs obtida, necessitam ser realizadas a fim de obter a proteína com grau de pureza significativo e em quantidades suficientes para a realização dos ensaios biofisicos e cristalográficos

The RNase L inhibitor (RLI) is a protein highly conserved in Eukaryota and Archaea and it was first identified in humans acting as a regulator of Oligoadenylate SynthetaselRNase L system (OASlRNase L), the main pathway induced by interferon. New functions have been described for RLI in different organisms, among them the control of RNA silencing and virus resistance. In order to further structural studies could subcIoned the coding sequence for the domain NBDs (nucIeotide-binding domain) AtRLI2 of Arabidopsis thaliana in expression vector pET-28a (+) capable of expressing the protein NBDs linked to a His6 tag. NBDs protein was expressed and purified by affinity chromatography on nickel in native condition using detergent Nlaurylsarcosine with a yield of about 8 mgIL and denaturing conditions using urea with a yield of about 10 mgIL. For renaturation of the protein was used dATP and magnesium chloride with subsequent dialysis resulting in a significant reduction in inclusion bodies and increasing the solubility of the protein produced in denaturant condition. To confirm the presence of residues HiS(; tag fusion protein with the NBDs, Western hlot tests were conducted using total extract of induced cells, the purified protein and protein originated from dialysis. It was concIuded that there was recognition of the monocIonal anti-His6 tag protein confirming the success of obtaining and purification of protein fused to a sequence of 6 histidines. Later stages of purification from the protein obtained NBDs are being conducted to obtain the pure protein 10 sufficient quantities for the testing biophysical and crystallographic
Keywords: Proteína AtLI2; Arabidopis - Genética - Estudos experimentais; Protein crystallography