Estudo comparativo das características e da eficácia de celulases de fungos endofíticos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado - Tesche, Luana Zanchetta [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017)
Os principais desafios para a produção de etanol celulósico se relacionam aos custos de obtenção das celulases, à disponibilização da celulose presente nos materiais lignocelulósicos (para maior rendimento da sacarificação enzimática), bem como à eficiente conversão da glicose liberada em etanol. As celulases microbianas têm sido extensivamente estudadas nos últimos anos, visando a sua aplicação no bagaço de cana-de-açúcar para liberação de açúcares fermentescíveis e posteriormente a produção de etanol celulósico. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da produção de celulases por oito fungos endofíticos, por fermentação em estado sólido (FES) e a utilização dos extratos enzimáticos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. Os fungos foram cultivados utilizando-se quatro misturas (1:1 p/p) de diferentes substratos lignocelulósicos, sendo selecionada para cada fungo, a mistura que proporcionou as maiores atividades de celulases nos extratos enzimáticos obtidos. Tais enzimas foram utilizadas na sacarificação do bagaço de cana submetido a pré-tratamento hidrotérmico alcalino (NaOH 5% p/v), o qual apresentou a vantagem de gerar uma baixa concentração de inibidores, seguindo três diferentes protocolos de sacarificação. Nesta etapa, foram selecionados os fungos Phomopsis stipata SC 04 (concentrações de glicose de 3,82 e 4,72 mg/mL nos hidrolisados obtidos pelos Protocolos 1 e 2 de sacarificação respectivamente) e Botryosphaeria sp. AM 01 (concentração de glicose de 4,01 mg/mL no hidrolisado obtido pelo Protocolo 2 de sacarificação). Foram realizados delineamentos experimentais visando a avaliação da influência das variáveis envolvidas na sacarificação. Para P. stipata SC 04 Protocolo 1, foram otimizadas as cargas de bagaço, endoglucanase e concentração de Tween 80 (15,364% e 288,07 U totais, 0,095% respectivamente), obtendo-se glicose em concentração 2,42 vezes superior, quando comparado com a sacarificação prévia. Quando se empregou o Protocolo 2 de sacarificação, utilizando-se P. stipata SC 04 ou Botryosphaeria sp. AM 01, foi possível otimizar as condições carga de bagaço pré-tratado e concentração de Tween 80 (9,27% e 0,283%, respectivamente, para o primeiro fungo; 7,17% e 0,8345%, respectivamente, para o segundo fungo). Assim, o uso de enzimas microbianas na sacarificação do bagaço de cana submetido a pré-tratamento hidrotérmico com NaOH levou a obtenção de hidrolisado com características adequadas para a utilização como fonte de glicose para produção de etanol celulósico, o que permitiu que a levedura Saccharomyces cerevisiae consumisse 85,8% da glicose presente em 24 horas de fermentação, produzindo 5,22 g/L de etanol celulósico.

The main challenges for cellulosic ethanol production have been related to cellulases costs, to the availability of cellulose in lignocellulosic materials (for higher yield of enzymatic saccharification), as well as to the efficient conversion of glucose in ethanol. Microbial cellulases have been extensively studied in the last years, aiming its application on sugarcane bagasse to release of fermentable sugars and later the cellulosic ethanol production. The present work had as objective the study of cellulase production by eight endophytic fungi by solid-state fermentation (SSF), and the use of the enzymatic extracts in saccharification of pre-treated sugarcane bagasse. The fungi were cultivated using four mixtures (1:1 w/w) of different lignocellulosic substrates, has being selected for each fungus, the mixture that provided the highest cellulases activities in the enzymatic extracts obtained. These enzymes were used in the saccharification of sugarcane bagasse submitted to alkaline hydrothermal pre-treatment (NaOH 5% w/v), which had the advantage of generates a low inhibitors concentration, following three different saccharification protocols. In this step, the fungi selected were Phomopsis stipata SC 04 (glucose concentration of 3.82 and 4.72 mg/mL in the hydrolysates obtained from saccharification Protocols 1 and 2, respectively), and Botryosphaeria sp. AM 01 (glucose concentration of 4.01 mg/mL in the hydrolysate obtained from saccharification Protocol 2). Experimental designs were performed aiming the evaluation of the influence of variables involved in saccharification. For P. stipata SC 04, using Protocol 1, the charges of bagasse, endoglucanase and Tween 80 were optimized (15.364% e 288.07 U totais, 0.095% respectively), obtaining glucose in concentration 2.42 times higher when compared to previous saccharification. When saccharification Protocol 2 was employed, using P. stipata SC 04 or Botryosphaeria sp. AM 01, it was possible to optimize the conditions of pre-treated bagasse charge and Tween 80 concentration (9.27% and 0.283%, respectively, for the first fungus; 7.17% and 0.8345%, respectively, for the second fungus). Therefore, the use of microbial enzymes in saccharification of sugarcane bagasse submitted to hydrothermal pre-treatment with NaOH led to achievement of hydrolysate with suitable characteristics for using as glucose source to cellulosic ethanol production, allowing the Saccharomyces cerevisiae to consume 85.8% of contained glucose in 24 hours of fermentation, producing 5.22 g/L of cellulosic ethanol.
Comparative study of the characteristics and efficacy of endophytic fungi cellulases in saccharification of pre-treated sugarcane bagasse
Keywords: Fungos endofíticos; Celulase; Bagaço de cana; Hidrólise; Biomassa