Identificação de Candida spp. de usuários de próteses removíveis por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (qPCR) combinada com a análise das curvas de dissociação - Vega Chacón, Yuliana Del Pilar [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Atualmente, o diagnóstico da candidíase oral (CO) associada ao uso de próteses dentária é realizado clinicamente, observando-se o grau de inflamação do palato. Os avanços da tecnologia molecular têm permitido realizar a identificação fúngica de maneira mais precisa por reação em cadeia de polimerase (PCR). A PCR combinada com a curva de dissociação têm sido reportadas para identificação fúngica de forma rápida e econômica. Entretanto, a utilização desse método para identificação fúngica em usuários de próteses não é conhecida. O objetivo deste estudo foi validar o método de qPCR com análise da curva de dissociação para a identificação de espécies de Candida isoladas de pacientes usuários de próteses. Para isso, foram utilizadas cepas padrão de C. albicans (Ca), C. glabrata (Cg), C. tropicalis (Ct), C. dubliniensis (Cd), C. krusei (Ck), C. guilliermondii (Cgl) e C. parapsilosis (Cp) e isolados clínicos de Ca (n = 13), Cg (n = 12) e Ct (n = 10) de pacientes com estomatite protética (EP). As cepas de Candida spp. foram cultivadas em CHROMAgar Candida, submetidas a extração de DNA e qPCR com análise das curvas de dissociação. Posteriormente, amostras clínicas foram coletadas de pacientes usuários de próteses com e sem EP (n = 20 cada) e submetidas aos mesmos procedimentos. Quando a identificação das amostras das próteses dos pacientes, não foi possível, essas foram cultivadas e submetidas à extração de DNA e qPCR com curva de dissociação. Os resultados foram analisados descritivamente, a concordância entre CHROMAgar Candida e qPCR-curva de dissociação foi avaliada pelo índice de kappa de Cohen (k) e os valores de sensibilidade, especificidade, preditivos positivos e negativos foram calculados para o CHROMAgar Candida. Entre os resultados, foi realizada a identificação por qPCR-curva de dissociação de 11, 10 e 4 isolados clínicos de Ca, Cg e Ct, verificando-se sensibilidade de 100% para Ca e Ct e especificidade de 100% para Cg. Com relação às amostras dos usuários de próteses, a identificação presuntiva demonstrou que em 35% de cada grupo a espécie isolada foi Ca. A identificação por qPCR-curva de dissociação foi possível em 11 amostras dos usuários de próteses de ambos os grupos (9 Ca e 2 Ct) sem cultivo prévio. Porém, não foi possível identificar as amostras de 5 e 4 pacientes com identificação presuntiva de Ca e Cg, além dos pacientes que apresentaram colonização mista. Com isso, as colônias desses pacientes foram cultivadas e identificadas por qPCR-curva de dissociação, sendo que 22 amostras foram identificadas como Ca, Cg, Ct e Cd. Entretanto, não foi possível identificar 7 amostras (1 uma espécie e 6 espécies mistas). Com isso, a concordância entre os dois métodos substancial (k=0,826), a sensibilidade de identificação por CHROMAgar Candida foi de 100% para Ca e a especificidade foi de 97% e 100% para Cg e Ct, respectivamente. Conclui-se que, com a metodologia utilizada, a qPCR-curva de dissociação permitiu a identificação de Ca e Ct de pacientes colonizados com uma espécie de Candida sem cultivo prévio, ao passo que, para identificação de Cg, Cd e espécies mistas, este método permitiu a identificação somente após o cultivo.

Currently, the diagnosis of oral candidiasis (OC) associated with the use of dental prostheses is performed clinically, observing the degree of inflammation of the palate. Advances in molecular technology have made it possible to perform fungal identification more accurately by polymerase chain reaction (PCR). PCR combined with the melting curve has been reported for fast and costeffective fungal identification. However, the use of this method for fungal identification in denture wearers is not known. The aim of this study was to validate the qPCR method with analysis of the melting curve for the identification of Candida species isolated from patients using dentures. For this, standard strains of C. albicans (Ca), C. glabrata (Cg), C. tropicalis (Ct), C. dubliniensis (Cd), C. krusei (Ck), C. guilliermondii (Cgl) and C. parapsilosis (Cp) and clinical isolates of Ca (n = 13), Cg (n = 12) and Ct (n = 10) from patients with denture stomatitis (SD). Candida spp. were grown on CHROMAgar Candida, subjected to DNA extraction and qPCR with analysis of melting curves. Subsequently, clinical samples were collected from denture wearers with and without SD (n = 20 each) submitted to the same procedures. When the identification of samples from the patients' prostheses was not possible, they were cultured and submitted to DNA extraction and qPCR with a melting curve. The results were descriptively analyzed, the agreement between CHROMAgar Candida and qPCR-melting curve was evaluated by the Cohen kappa index (k) and the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values were calculated for CHROMAgar Candida. Among the results, the identification by qPCR-melting curve of 11, 10 and 4 clinical isolates of Ca, Cg and Ct was performed, verifying a sensitivity of 100% for Ca and Ct and a specificity of 100% for Cg. Regarding samples from denture users, presumptive identification showed that in 35% of each group, the isolated species was Ca. Identification by qPCR-melting curve was possible in 11 samples from denture wearers of both groups (9 Ca and 2 Ct) without previous culture. However, it was not possible to identify samples from 5 and 4 patients with presumptive identification of Ca and Cg, in addition to patients who presented mixed colonization. Thus, the colonies of these patients were cultured and identified by qPCR-melting curve, and 22 samples were identified as Ca, Cg, Ct and Cd. However, it was not possible to identify 7 samples (1 one species and 6 mixed species). Thus, the agreement between the two methods was substantial (k=0.826), the sensitivity of identification by CHROMAgar Candida was 100% for Ca and the specificity was 97% and 100% for Cg and Ct, respectively. It is concluded that, with the methodology used, the qPCR-melting curve allowed the identification of Ca and Ct of patients colonized with a Candida species without previous culture, whereas, for the identification of Cg, Cd and mixed species, this method allowed identification only after cultivation.
Identification of Candida spp. of removable denture wearers by quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) combined with melting curves analysis
Keywords: Candida albicans; Candidíase; Reação em Cadeia da Polimerase; Estomatite sob Prótese; DNA; Candidiasis; Polymerase Chain Reaction; Stomatitis; Denture; DNA; Candida albicans