Perfil proteômico salivar e degradação de histatinas em indivíduos com síndrome de Down e doença periodontal - Domingues, Natalia Bertolo [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil proteômico e a proteólise da histatina 1 e da histatina 5 na saliva total estimulada de indivíduos com síndrome de Down (SD) e não-sindrômicos (NS) na presença e na ausência da doença periodontal (DP). Foram selecionados 24 indivíduos, os quais foram divididos em 4 grupos experimentais (n=6): SD com DP (SDcDP), SD sem DP (SDsDP), não sindrômicos com DP (NScDP) e não sindrômicos sem DP (NSsDP - controle). Inicialmente, os participantes passaram por exame clínico intra-bucal para avaliação da condição periodontal e determinação do índice CPO-D. Foi realizada a coleta da saliva estimulada até a obtenção de 3,0 mL. Parte da saliva foi utilizada para a análise microbiológica e parte foi centrifugada para obtenção do sobrenadante da saliva total (SST), aliquotada e armazenada em freezer -80ºC para as análises proteômica e de degradação. Os níveis salivares de Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis foram quantificados pela Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR). A análise espectrométrica foi realizada com os pools de saliva de cada um dos quatro grupos, os quais foram submetidos a nLC-ESI-MS/MS (Cromatografia Líquida por ionização electrospray Tandem Espectrometria de Massas). A degradação proteica foi realizada pela adição de histatina 1 e histatina 5 sintéticas ao SST diluído (1:10) e incubação à 37ºC pelos tempos 0, 0,5, 1,5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas. Em seguida, foram realizadas as análises de eletroforese em gel de policrilamida (PAGE) catiônica e mensuração da densidade das bandas (%) das imagens obtidas. Os dados clínicos e microbiológicos foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis, complementado pelo teste de Dunn, e os dados de proteína total e degradação das histatinas foram avaliados por Anova seguida pelos pós-testes de Tukey e Bonferroni, respectivamente (=0,05). Os espectros obtidos na análise proteômica foram confrontados com base de dados específica e apresentados de forma descritiva. Os indivíduos com SD apresentaram redução significativa no fluxo salivar (p=0,001). Não houve diferença significativa para o índice CPO-D entre os grupos (p=0,158), enquanto que para os parâmetros periodontais diferenças estatísticas foram observadas, entre os grupos sem DP e com DP (p≤0,003). Com relação a quantidade de bactérias periodontopatogênicas, não houve diferença entre os grupos para Aa (p=0,803), por outro lado, níveis significativamente aumentados de Pg foram verificados no grupo NScDP em comparação aos grupos sem DP (p=0,022). A concentração de proteína total foi significativamente maior no grupo SDcDP (p≤0,0001). Um total de 1855 proteínas foram identificadas nas amostras de pool de saliva, sendo 31 comuns para os quatro grupos, porém com diferentes abundâncias, 11 exclusivas para os indivíduos com SD e 33 exclusivas para a DP. A degradação das histatinas 1 e 5 foi maior na presença da DP (p≤0,0001). A densidade das bandas sofreu influência do período de incubação (p≤0,0001) e do tipo de histatina (p≤0,0001), sendo observada maior taxa de degradação quanto maior o período de incubação e para a histatina 5 comparada à histatina 1. Além disso, foi observada uma maior taxa de degradação da histatina 1 na presença da SD (p=0,036). Pode-se concluir que: (1) existem diferenças de abundância de algumas proteínas na presença da SD e da DP, (2) a histatina 1 é mais resistente à proteólise do que a histatina 5, e (3) a degradação das histatinas 1 e 5 ocorre mais rapidamente na presença da DP e apenas a degradação da histatina 1 sofre influência da presença da SD.

This study aimed to evaluate the proteomic profile and histatins 1 and 5 proteolysis in stimulated whole saliva of individuals with Down syndrome (DS) and non-syndromics (NS) in the presence and absence of periodontal disease (PD). Twenty-four individuals were selected and divided in the following groups (n=6): DS with PD (DSwPD), DS without PD (DSwtPD), NS with PD (NSwPD) and NS without PD (NSwtPD – control). First, periodontal condition and DMFT index were evaluated and 3.0 mL of stimulated whole saliva was collected. Then, part of whole saliva was used to microbiological analysis and the remaining samples were centrifuged in order to obtain the whole saliva supernatant (WSS), aliquoted and stored at -80ºC to proteomic and degradation assays. Levels of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) were quantified by real-time polymerase chain reaction (qPCR). Spectrophotometric analyses were carried out with saliva pools of each group by using nLC-ESI-MS/MS (Liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry). Protein degradation assay was carried out with synthetic histatins 1 or 5 added to WSS (1:10) followed by samples incubation at 37°C for 0, 0.5, 1.5, 4, 6, 8, 24 and 48 hours. Next, polyacrylamide cationic gel electrophoresis (PAGE) analysis and measurement of bands density (%) were performed. Kruskal-Wallis test complemented by Dunn's test was applied to analyze clinical and microbiological data. Total protein and histatins degradation were evaluated by using Anova followed by Tukey’s and Bonferroni post hoc tests, respectively (a=0.05). The acquired spectra obtained from proteomic analysis were searched against specific protein database and descriptive statistics was used. Individuals with DS showed reduced salivary flow rate (p=0.001). There was no significant differences for the DMFT index between groups (p=0.158), while it was noticed significant differences in periodontal parameters between groups with PD and without PD (p≤0.003). Regarding amounts of periodontopathogenic bacteria, there were no significant differences between groups to Aa (p=0.803). On the other hand, higher significant levels of Pg were verified in NSwPD group compared to groups without PD (p=0.022). Total protein concentration was significantly higher in DSwPD group (p≤0.0001). A total of 1855 proteins were identified in the pool of saliva samples, being 31 in common to all groups, however with different abundances. It was also verified 11 exclusive proteins in individuals with DS and 33 exclusive proteins in individuals with PD. It was noticed that the degradation occurs faster in the presence of PD for both histatins (p≤0.0001). Bands density were influenced by incubation period (p≤0.0001) and by the histatin type (p≤0.0001). A higher degradation rate of histatin 5 was observed in comparison to histatin 1, and as longer as incubation period the greater was the degradation rate of these histatins. In addition, it was observed a higher degradation rate for histatin 1 in the presence of DS (p=0.036). It can be concluded that: (1) there are differences in the abundance of some proteins in the presence of DS and PD, (2) histatin1 is more resistant to proteolysis than histatin 5, and (3) histatins 1 and 5 degradation occurs faster in the presence of PD and only histatin 1 degradation is influenced by the presence of DS.
Salivary proteomic profile and histatins 1 and 5 degradation in individuals with Down syndrome and periodontal disease
Keywords: Síndrome de Down; Saliva; Proteólise; Doenças periodontais; Down syndrome; Saliva; Proteolysis; Periodontal diseases