Avaliação do efeito de IFN-γ e TNF-α no perfil proteômico e de expressão gênica de cardiomiócitos humanos portadores da variante patogênica heterozigota R135C no gene DHODH associada à cardiopatia chagásica crônica - Zonzin, Guilherme Fahl [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
A doença de Chagas (DC) é causada pelo Trypanosoma cruzi e afeta de 6 a 7 milhões de pessoas em todo o mundo. Cerca de 30% dos infectados desenvolvem a cardiopatia chagásica crônica (CCC), uma cardiomiopatia inflamatória associada à lesão tecidual, fibrose, hipertrofia e complicações fatais. O perfil inflamatório característico da CCC é rico em células T Th1 com intensa produção de IFN-γ e TNF-α, citocinas conhecidas por induzir disfunção mitocondrial. A redução do metabolismo energético e disfunção mitocondrial no coração é um achado importante em pacientes CCC e relevante para o metabolismo cardíaco, tendo em vista a alta demanda energética do coração. A variante heterozigota rara no gene da enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) R135C foi identificada por meio do sequenciamento de exoma em famílias com múltiplos casos de DC juntamente com outras variantes apenas em casos de CCC, mas não nos irmãos/parentes com a forma indeterminada da doença. Esta variante determina a perda de função da DHODH, uma enzima mitocondrial que participa da síntese de pirimidinas e da fosforilação oxidativa por meio da doação de elétrons para o complexo III da cadeia respiratória. Considerando os efeitos do IFN-γ e TNF-α sobre a disfunção mitocondrial e o cenário genético encontrado nas famílias estudadas, este trabalho busca investigar a contribuição da variante DHODH R135C para a função mitocondrial através da análise do perfil proteômico e de expressão gênica de cardiomiócitos humanos editados por CRISPR-Cas9 estimulados com IFN-γ e TNF-α. Este conhecimento é relevante para a maior compreensão acerca da patogênese da CCC e da relação entre aspectos genéticos, imunológicos e metabólicos no desenvolvimento e progressão da doença. Clones CRISPR AC16 portadores ou não da variante DHODH R135C foram propagados em cultura para ensaios experimentais. Foi determinado o perfil de citotoxicidade do tratamento com citocinas proposto pela metodologia, estabelecida uma curva de crescimento individual para cada célula e confirmado o genótipo dos clones por meio de sequenciamento de Sanger. As células foram tratadas com 10 ng/mL de IFN-γ mais 5 ng/mL de TNF-α ou 50 ng/mL de IFN-γ mais 50 ng/mL de TNF-α por 48h e coletadas para as próximas etapas experimentais. O efeito das citocinas sobre os clones foi confirmado através do ensaio simultâneo de avaliação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) por fluorescência de TMRM. O tratamento com citocinas induziu queda do MMP em ambos clones, com efeito ainda mais pronunciado no clone mutante. O clone mutante exibiu maior capacidade de captação de TMRM, sugerindo uma possível hiperpolarização basal.

Chagas disease (CD) is caused by Trypanosoma cruzi and affects 6 to 7 million people worldwide. Approximately 30% of infected individuals develop chronic chagasic cardiomyopathy (CCC), an inflammatory cardiomyopathy associated with tissue damage, fibrosis, hypertrophy and fatal complications. The inflammatory profile characteristic of CCC is rich in Th1 T cells with intense production of IFN-γ and TNF-α, cytokines known to induce mitochondrial dysfunction. Reduced energy metabolism and mitochondrial dysfunction in the heart is a significant finding in CCC patients and is highly relevant to cardiac metabolism given the high energy demands of the heart. The rare heterozygous R135C variant in the dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) gene was identified by exome sequencing in families with multiple cases of CD, along with other variants found exclusively in CCC cases but not in siblings/relatives with the indeterminate form of the disease. This variant leads to a loss of function of DHODH, a mitochondrial enzyme involved in pyrimidine synthesis and oxidative phosphorylation by donating electrons to complex III of the respiratory chain. Considering the effects of IFN-γ and TNF-α on mitochondrial dysfunction and the genetic scenario found in the studied families, this work aims to investigate the contribution of the DHODH R135C variant to cytokine-induced mitochondrial function through proteomic and gene expression profiling of human cardiomyocytes edited by CRISPR-Cas9 to incorporate the DHODH R135C variant, and stimulated with IFN-γ and TNF-α. This knowledge is crucial for a better understanding of the pathogenesis of CCC and the relationship between genetic, immunological and metabolic aspects in the development and progression of the disease. CRISPR-Cas9 edited AC16 clones, carrying or not the DHODH R135C variant, were propagated in culture for experimental assays. The cytotoxicity profile of the cytokine treatment proposed by the methodology was determined, individual growth curves were generated for each cell line, and the genotype of the clones was confirmed by Sanger sequencing. The cells were treated with 10 ng/mL IFN-γ plus 5 ng/mL TNF-α or 50 ng/mL IFN-γ plus 50 ng/mL TNF-α for 48 hours and collected for subsequent experimental steps. The effect of cytokines on the clones was confirmed by a simultaneous mitochondrial membrane potential (MMP) assay using TMRM fluorescence. Cytokine treatment induced a decrease in MMP in both clones, with a more pronounced effect in the mutant clone. The mutant clone showed a higher capacity for TMRM uptake, suggesting a possible basal hyperpolarization.
Evaluation of the effect of IFN-γ and TNF-α on the proteomic and gene expression profile of human cardiomyocytes carrying the heterozygous pathogenic R135C variant in the DHODH gene associated with chronic chagasic cardiomyopathy
Keywords: Cardiopatia chagásica crônica; Citocinas; Diidroorotato desidrogenase (DHODH); Disfunção mitocondrial; Mitocôndria