Nogueira, Marcelo Fábio Gouveia [UNESP]Pioltine, Elisa Mariano2020-04-222020-04-222020-02-20http://hdl.handle.net/11449/192297Embora estágios iniciais de embriões de mamíferos tenham aparentemente uma grande plasticidade, eles, assim como o oócito em maturação, são bastante sensíveis a estresses exógenos. Responder a esses estresses é uma parte vital da fisiologia celular. Cada vez mais é aparente que um dos principais mecanismos, para iniciar a resposta celular a uma variedade de estressores exógenos, reside no retículo endoplasmático (RE). O RE é uma importante organela responsável pela síntese, processamento e transporte de proteínas e lipídeos. No entanto e in vitro, a perturbação do microambiente do RE pode causar alterações na estrutura das proteínas levando ao acúmulo de proteínas com o incorreto dobramento, uma condição denominada estresse do RE. Dependendo da intensidade do estresse, o RE pode desencadear a apoptose pela Unfolded Protein Response. Em várias espécies, estudos observaram uma melhoria da competência do oócito e no desenvolvimento do embrião quando foram adicionados inibidores do estresse do RE no meio de maturação e/ou meio de cultivo in vitro (CIV). Dentre os inibidores do estresse do RE, o ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) se mostrou benéfico na produção in vitro de embriões. Entretanto, pouco é conhecido sobre o seu efeito na maturação oocitária e no desenvolvimento do embrião bovino in vitro. Portanto, os objetivos gerais desta Tese foram: Capítulo 1 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante a maturação in vitro (MIV) sobre a competência do oócito e do embrião [maturação nuclear, atividade mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), formação de pro núcleo, formação de blastocisto e abundância de transcritos em oócitos e embriões] e Capítulo 2 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante o CIV sobre a competência embrionária e a criotolerância do embrião (cinética de eclosão e abundância de transcritos de embriões antes e após a vitrificação). A adição de TUDCA na MIV não melhorou a competência oocitária. Entretanto, a adição de 200 µM de TUDCA pareceu aliviar o estresse do RE reduzindo a produção de ERO no oócito e aumentando a abundância de transcritos relacionados positivamente com a defesa antioxidante do oócito e do embrião. Contrariamente, a adição de 1.000 µM de TUDCA na MIV pareceu ser tóxica para o oócito e diminuiu a taxa de maturação nuclear bem como a atividade mitocondrial. Além disso, houve um aumento da abundância de transcritos pró-apoptóticos no oócito. Quando o TUDCA foi suplementado no CIV não houve melhora da competência embrionária. De forma semelhante que na MIV, a adição de 1.000 µM de TUDCA no CIV pareceu ser tóxica para o embrião e diminuiu a taxas de blastocisto eclodido. De modo complementar, houve um aumento da abundância de transcritos relatados negativamente com o estresse do RE, o estresse oxidativo, o metabolismo lipídico e a sobrevivência celular. Entretanto, a adição de 200 µM de TUDCA no CIV pareceu aliviar o estresse do RE em embriões submetidos à vitrificação. Com isso, houve o aumento da taxa de embrião eclodido após o aquecimento. Além disso, nos blastocistos eclodidos pós-aquecimento foi observada uma redução da abundância de transcritos relacionados negativamente com o estresse do RE e um aumento daqueles relacionados positivamente com o mecanismo antioxidante e o desenvolvimento embrionário.Although early stages of mammalian embryos appear to retain great plasticity, they and maturing oocytes are quite sensitive to exogenous stresses. Responding to those stresses is a vital part of cellular physiology, and it is increasingly apparent that one of the main mechanisms for initiating that response is based on the endoplasmic reticulum (ER). ER is an important organelle responsible for the synthesis, processing, folding and transport of proteins and lipids. However, in vitro, the disturbance of the ER microenvironment can cause changes in the structure and folding of proteins leading to the accumulation of misfolding proteins, a condition called ER stress. Depending on the intensity of the stress, the ER can trigger apoptosis by Unfolded Protein Response. In several species, studies have reported an improvement in oocyte and embryo competence when ER stress inhibitors have been added to the in vitro maturation (IVM) medium and/or in vitro culture (IVC) medium. Among the ER stress inhibitors, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) has been shown to be beneficial in in vitro embryo production. However, little is known about TUDCA’s effect on oocyte maturation and the development of bovine embryo in vitro. Therefore, the main objectives of this Thesis were: Chapter 1 - to investigate the effect of adding different TUDCA concentrations during IVM on the oocyte and embryo competence [nuclear maturation, mitochondrial activity, reactive oxygen species (ROS) production, pronuclei formation, blastocyst formation and transcripts abundance in oocytes and embryos]; and Chapter 2 – to investigate the effect of adding different TUDCA concentrations during IVC on embryo competence and embryo cryotolerance (hatching kinetics and transcripts abundance in embryo before and after the vitrification). The TUDCA addition to the IVM did not improve oocyte competence. However, the 200 µM of TUDCA appeared to relieve ER stress and reduced the ROS production in the oocyte. Concomitantly, there was an increasing of the transcripts abundance positively reported to the antioxidant defense in the oocyte and embryo. In contrast, the 1,000 µM of TUDCA appeared to be toxic to the oocyte by decreasing the nuclear maturation rate and mitochondrial activity in the oocyte. Moreover, there was an increasing of the pro-apoptotic transcripts’ abundance in the oocyte. When TUDCA was supplemented in IVC there was no improvement in embryo competence. As in IVM, the 1,000 µM of TUDCA appeared to be toxic to the embryo - decreasing the hatched blastocyst rate and increasing the transcripts’ abundance negatively reported in ER stress, oxidative stress, lipid metabolism and cell survival. However, the 200 µM of TUDCA addition in the CIV seemed to relieve ER stress in the embryos subjected to vitrification, increasing the hatched embryo rate post-warming. In addition, in hatched blastocysts post-warming it was observed a reduction of the transcripts’ abundance negatively reported to the ER stress and an increasing of those positively reported to the antioxidant mechanism and the embryo development.porTUDCAOócitoBlastocistoEstresse do retículo endoplasmáticoVitrificaçãoBovinoEndoplasmic reticulum stressVitrificationCattleTese de doutoradoAcesso aberto00093013933004064052P0