Memória espacial e neuroquímica do hipocampo em modelo animal de autismo - Spilla, Caio Sergio Galina [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018)
Reações imunes geradas no organismo materno durante o período gestacional podem provocar alterações no desenvolvimento do feto. O LPS, endotoxina lipopolissacarídea presente na parede das bactérias gram-negativas, é capaz de gerar a produção de citocinas, mimetizando dessa forma um quadro de inflamação pré-natal quando administrado na fêmea prenhe durante o período gestacional. A prole de ratas prenhes expostas a esta endotoxina pode apresentar assim diversos problemas comportamentais e/ou cognitivos que refletem alterações ocorridas no sistema nervoso central (SNC) durante o seu desenvolvimento. Entre as diversas patologias que podem resultar de um transtorno no neurodesenvolvimento está o transtorno do espectro autista (TEA). Ainda sem uma causa definida em humanos, estima-se que cerca de uma a cada 150 crianças nascidas atualmente são acometidas por essa patologia. Distúrbios de comportamento e de comunicação/interação social constituem a díade que caracteriza o TEA e dependendo do grau de acometimento é comum encontrar também nestes e de forma geral em indivíduos com transtornos de neurodesenvolvimento problemas atencionais, de aprendizado e memória. O quadro inflamatório no período de gestação causa uma série de alterações no organismo materno, sendo que algumas destas alterações alcançam o feto em desenvolvimento. Uma destas alterações pode ser a redução no conteúdo de melatonina na circulação materna e fetal. A melatonina, hormônio produzido pela glândula pineal, apresenta funções sincronizadora, antioxidante e neuroprotetora que podem ser importantes durante o neurodesenvolvimento e a alteração na síntese e liberação desse hormônio no organismo materno ao longo da gestação vem sendo correlacionada a casos de TEA. Além disso, a exposição ao LPS durante o desenvolvimento do SNC em um modelo animal resulta em uma prole que apresenta comportamentos autísticos. Apesar destes dados, os efeitos desse quadro pré-natal no comportamento, na morfologia e na neuroquímica de áreas encefálicas da prole ainda não foram totalmente esclarecidos e sua elucidação pode contribuir como base de conhecimento para estudos que investiguem prevenção e terapias farmacológicas ou comportamentais nessas patologias. O presente trabalho teve como objetivos verificar se o quadro inflamatório pré-natal induzido por LPS: 1) Altera a concentração plasmática de melatonina materna, 2) altera a expressão de comportamentos que dependem da função de memória espacial e 3) induz mudanças morfométricas e neuroquímicas no hipocampo. Para atingir o primeiro objetivo foi coletado o sangue de ratas prenhe 3 h (fase de claro) e 16 h (fase de escuro) após à exposição ao LPS ou a solução salina e a dosagem de melatonina foi realizada por meio do método ELISA. Para alcançarmos o segundo e terceiro objetivos as proles de ratas expostas ao LPS e de ratas controles expostas a solução salina no dia gestacional 9,5 foram avaliadas por meio de teste comportamental de alternância espontânea no labirinto em T. Em seguida, os animais foram perfundidos e os encéfalos processados para o estudo do volume hipocampal por estereologia, para análise de expressão neuronal das proteínas ligantes de cálcio calretinina e parvalbumina e para análise de expressão glial da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e da proteína de associação de ligação ao cálcio ionizada – 1 (IBA-1) por meio da técnica de imunohistoquímica. Os resultados mostraram que houve queda no conteúdo plasmático de melatonina noturno e aumento no conteúdo diurno após injeção com LPS nas fêmeas prenhes. A prole do grupo controle apresentou melhor desempenho no teste comportamental quando comparado a prole do grupo LPS. O hipocampo da prole do grupo LPS não apresentou diferença de volume total do desta estrutura em comparação ao grupo controle. Também não houve alteração na expressão de GFAP em astrócitos hipocampais no grupo LPS em relação ao controle. Por outro lado, ocorreu aumento na expressão de IBA-1, marcador de microglia, nas regiões do CA1, CA2 e CA3 no hipocampo da prole do grupo LPS em relação a prole do grupo controle. A prole do grupo LPS, considerada um modelo animal de autismo também apresentou variações na expressão das proteínas ligantes de Cálcio no hipocampo com menor expressão da proteína parvalbumina e maior expressão da proteína calretinina que o grupo controle. Os resultados mostraram que a exposição materna ao LPS foi capaz de alterar a concentração de melatonina plasmática circulante e que a prole exposta a esse ambiente inflamatório pré-natal apresentou alterações de comportamento dependente da memória espacial. Além disso, os resultados nos permitem concluir que tais alterações na memória espacial não são coincidentes com alterações no volume do hipocampo ou na reatividade astrocitária, mas sim com a ativação microglial e com alterações na neuroquímica dos neurônios gabaérgicos hipocampais que expressam as proteínas ligantes de cálcio e que conhecidamente controlam as conexões excitatórias e inibitórias envolvidas nos fenômenos de memória.

Immune reactions generated in the maternal organism during the gestational period may cause changes in the fetal development. The endotoxin lipopolysaccharide (LPS) present on the wall of Gram-negative bacteria is able to induce the production of cytokines, mimicking a state of prenatal inflammation when administered in the pregnant female during the gestational period. The offspring of pregnant rats exposed to this endotoxin may present several behavioral and/or cognitive problems that reflect changes in the central nervous system (CNS). The autism spectrum disorder (ASD) is one of this neurodevelopmental conditions, and although without a definite cause in humans, is related to be present in one to every 150 children born. Behavior and communication/social interaction disorders constitute the dyad that characterizes the ASD. Besides these, depending on the degree of involvement it is common to find in these individuals‟ attention, learning and memory problems. Melatonin, a hormone produced by the pineal gland, presents several functions during neurodevelopment and the alteration in the synthesis and release of this hormone in the maternal organism throughout pregnancy has been correlated to cases of ASD. Investigations about the effects of a prenatal inflammatory condition in behavior, in the morphology and neurochemistry of brain areas can contribute for future pharmacological or behavioral studies in these patients. Considering that exposure to LPS during the development of CNS in an animal model results in offspring presenting autistic behaviors, the present work aimed to check whether the prenatal inflammatory condition: 1) Changes the maternal melatonin plasma concentration, 2) alters behaviors that depend on the spatial memory function and 3) induces morphometric and neurochemical changes in the hippocampus. For this, blood from pregnant rats 03h and 16h after LPS exposure was collected and the melatonin dosage was performed using the ELISA method. Offsprings of rats exposed to the LPS (autism model) or saline (control) on the 9.5 gestational day were evaluated in the T-maze spontaneous alternation test. After, the animals were perfused with 4% paraformaldehyde and the brains were processed for the hippocampal volume quantification and for the analysis of the calretinin, parvalbumin, glial fibrillary acidprotein (GFAP) and ionized calcium binding association protein – 1 (IBA-1) expression by immunohistochemistry. There was difference in the plasma melatonin dosage in the day and night periods of the pregnant females of the control group and the LPS group. The results showed that the control group presented better performance in behavioral testing when compared to the autism model. The hippocampal volume showed no difference between the groups, as well as the expression of the GFAP in astrocytes. There was an increase in IBA-1 expression in all regions of the hippocampus except in the dentate gyrus in the autism model group in relation to the control group.The autism model presented lower expression of the parvalbumin and greater expression of de calretinin than the control group. The results showed that maternal exposure to LPS was able to alter maternal plasma melatonin concentration and that the offspring exposed to prenatal inflammatory environment showed deficits in behaviors dependent of spatial memory and indicate that these behaviors deficits are not coincident with changes in the hippocampal volume or in astrocytic reactivity, but but with microglial activation and with changes in the calcium binding proteins expression in gabaergic neurons of the hippocampus which are known to control excitatory and inhibitory sinapses involved in the memory phenomena.
Space memory and neurochemical of hippocampus in animal model autism
Keywords: Autismo; Aprendizagem; Hipocampo; Neurodesenvolvimento; Neuroinflamação; Autism; Learning; Hippocampus; Neurodevelopment; Neuroinflammation