Isolamento e criopreservação de espermatogônia tronco de Pseudopimelodus mangurus e análises preliminares de ciclosporina A como imunossupressor em receptores de células germinativas - Pessoa, Giselle Pessanha [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
A região Neotropical abriga a maior diversidade de peixes continentais do mundo, grande parte descrita em território brasileiro. Aproximadamente 10% dessa ictiofauna está ameaçada de extinção, principalmente devido a ações antrópicas. Diversas áreas do conhecimento têm voltado a atenção para a conservação da biodiversidade aquática, como o transplante interespecífico de células germinativas. Esta técnica permite que uma espécie de peixe produza gametas de outra espécie, podendo atuar na conservação de peixes ameaçados de extinção. Pseudopimelodus mangurus (Siluriformes) foi utilizado para estudo como doador de espermatogônias-tronco e Astyanax altiparanae (Characiformes) como receptor. As espermatogônias-tronco de P. mangurus foram obtidas pela associação das técnicas de dissociação enzimática, gradiente de densidade de Percoll e plaqueamento diferencial. A pureza de espermatogônias-tronco após o plaqueamento diferencial foi de 60,14% ± 2,93%, sendo 6% maior que no gradiente de densidade de Percoll. A análise da expressão relativa de ddx4 e da atividade da fosfatase alcalina em espermatogônias-tronco evidenciaram suas características de células tronco. As espermatogônias-tronco foram criopreservadas utilizando cinco 5 crioprotetores, em três molaridades distintas. O propanediol a 1 M melhor preservou a integridade e viabilidade celular. Os receptores de A. altiparanae foram produzidos pela combinação das técnicas de manipulação cromossômica e esterilização química com busulfan, sendo obtida a depleção da espermatogênese. Leucócitos de A. altiparanae foram cultivados in vitro nas concentrações 0,1, 0,15 e 0,2 µg/µL de ciclosporina A (CsA). A viabilidade e concentração dos leucócitos diminuíram nas 24 e 48 h do cultivo, sendo que a menor concentração de CsA resultou na maior viabilidade leucocitária. Na avaliação da CsA in vivo foram utilizados juvenis triploides de A. altiparanae separados nos seguintes grupos, (i) não esterilizados com busulfan, (ii) esterilizados com busulfan, (iii) esterilizados e injetados com emulsão, (iv) esterilizados e injetados com 20 mg/kg de CsA e (v) esterilizados e injetados com 40 mg/kg de CsA. As amostras foram submetidas às análises histológicas do rim cranial e gônada, de expressão da interleucina-1β (IL-1β) em rim cranial e contagem de leucócitos por esfregaço sanguíneo, anterior a aplicação de CsA e aos 5 e 10 dias após. Não houve diferença quanto aos aspectos histológicos de rim cranial ou das gônadas entre os grupos. A expressão de IL-1β foi diminuída nos rins dos animais administrados com CsA em ambas concentrações. A administração de CsA diminuiu o número de células brancas no sangue e conduziu a anemia nos animais. O uso de imunossupressor pode melhorar a eficiência do transplante interespecífico de espermatogônias em ações de conservação.

The Neotropical region has the greatest fish diversity of continental waters in the world, and most of it is described in Brazilian territory. Approximately 10% of this ichthyofauna is endangered by extinction, mainly due to anthropic actions. Several areas of knowledge have turned their attention to aquatic biodiversity conservation techniques, such as the interspecific transplantation of germ cells. This technique allows one species of fish to produce gametes of another species, which can act in the conservation of endangered fish. Pseudopimelodus mangurus (Siluriformes) was used to study as a spermatogonial stem cell donor, and Astyanax altiparanae (Characiformes) was used as a recipient. P. mangurus spermatogonial stem cells were obtained by enzyme dissociation, Percoll density gradient, and differential plating techniques. The ddx4 relative expression and the activity of alkaline phosphatase analysis in spermatogonia stem showed their characteristics of stem cells. Spermatogonia stem cells were cryopreserved using five cryoprotectants in three different molarities. Propanediol (1 M) was the best cryoprotectant to preserve cell integrity and viability. A. altiparanae recipients were produced using chromosomal manipulation and chemical sterilization with busulfan, as previously reported, and the results showed spermatogenesis depletion. A. altiparanae leukocytes were cultured in vitro at 0.1, 0.15, and 0.2 μg/μL cyclosporin A (CsA) concentrations. Leukocyte viability and concentration decreased at 24 and 48 hours of culture, and the lowest concentration of CsA resulted in the highest leukocyte viability. Juvenile A. altiparanae triploids were used to evaluate CsA in vivo into the following groups: (i) nonsterilized with busulfan, (ii) sterilized with busulfan, (iii) sterilized and emulsion injected, (iv) sterilized and injected with 20 mg/kg of CsA and (v) sterilized and injected with 40 mg/kg of CsA. The samples were analyzed by histology of the cranial kidney and gonads, expression of interleukin-1β (IL-1β) in the cranial kidney, and leukocyte count by blood smear before the application of CsA and at 5 and 10 days after. There was no difference between the groups concerning histological aspects of the cranial kidney or the gonads. IL-1β expression was decreased in the kidneys of animals administered CsA at both concentrations. Administration of CsA decreased the number of white blood cells and led to anemia in the animals. The use of immunosuppressants can improve the efficiency of interspecific spermatogonial transplantation in conservation actions.
Isolation and cryopreservation of stem spermatogonia of Pseudopimelodus mangurus and preliminary analyzes of cyclosporine A as an immunosuppressant in germ cell receptors
Keywords: Conservação; Busulfan; Manipulação cromossômica; Quimera germinativa; Esterilização química; Ciclosporina A