Correlações espermáticas e caracterização de um potencial biomarcador de fertilidade em seres humanos: proteína espermática SP22 - Rosa, Josiane de Lima [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019)
A infertilidade afeta aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva, sendo o homem responsável por cerca da metade dos casos. A diminuição da fertilidade masculina é devido a uma variedade de condições que incluem malformações congênitas, distúrbios genéticos e endócrinos, doenças infecciosas e inflamatórias, disfunção sexual e estilo de vida. A proteína espermática SP22 (sperm protein, 22kDa) tem demonstrado ser um biomarcador de fertilidade masculina, visto que, em ratos, está bem estabelecido que sua concentração, em extratos de espermatozoides da cauda epididimária, se correlaciona com a fertilidade desses gametas. No entanto, para incorporar essa proteína como um biomarcador em estudos epidemiológicos e clínicos são necessários dados quantitativos em humanos. Assim, o presente estudo teve por objetivos padronizar a técnica de quantificação e imunolocalização da proteína espermática SP22, investigar possíveis correlações entre parâmetros seminais convencionais e funcionais, de homens férteis e inférteis, com a concentração dessa proteína e avaliar o seu potencial preditivo como um biomarcador, não invasivo, de fertilidade. Para tanto foram realizados dois estudos observacionais: um do tipo caso-controle e outro do tipo seccional. O estudo caso-controle foi desenvolvido em amostras seminais de 44 voluntários da cidade de Botucatu e região, com idade entre 20 a 50 anos, que foram agrupados de acordo com a fertilidade: férteis (um ou mais filhos) e inférteis. Já o estudo seccional foi conduzido em amostras seminais de 12 pacientes inférteis atendidos pelo Centro de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, também com idade entre 20 a 50 anos. Em ambos os estudos foram excluídos aqueles casais cujo fator feminino de infertilidade estava presente. Foram realizadas padronização de protocolos multiparamétricos para a avaliação funcional dos espermatozoides pela técnica de citometria de fluxo, análises seminais convencionais e funcionais, quantificação e imunolocalização da proteína espermática SP22. A correlação entre alguns parâmetros foi investigada. Este estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP e os indivíduos incluídos forneceram consentimento por escrito. Os voluntários inférteis exibiram redução no volume e no número total de espermatozoides do ejaculado bem como no volume, concentração espermática e número total de espermatozoides pós swim-up. Tanto os voluntários inférteis como os pacientes inférteis apresentaram porcentagem menor de células com morfologia normal. A motilidade progressiva rápida foi outro parâmetro de qualidade seminal que se mostrou reduzida nos pacientes inférteis. Além das alterações em alguns parâmetros seminais, os voluntários inférteis também exibiram redução na concentração sérica do LH. As análises dos coeficientes de determinação indicaram que os protocolos multiparamétricos propostos são adequados. Apesar de não terem sido observadas diferenças significativas entre os grupos com relação aos parâmetros seminais funcionais, os danos na membrana plasmática foram positivamente correlacionados com a produção de ânion superóxido na matriz mitocondrial. A imunolocalização revelou que a SP22 está presente, dentre outros locais, no segmento equatorial da cabeça do espermatozoide. A análise da concentração dessa proteína, realizada até o momento, não foi significativamente diferente entre os voluntários férteis e inférteis bem como não foi correlacionada com nenhum dos parâmetros investigados. Portanto, a avaliação das amostras seminais remanescentes, inclusive utilizando anticorpos monoclonais altamente purificados por afinidade, que se encontra em andamento, será fundamental para complementar o presente estudo. De qualquer forma, este é um passo inicial importante no sentido de caracterizar a SP22 como um potencial biomarcador não invasivo preditivo de fertilidade/infertilidade em humanos, podendo vir a subsidiar estudos epidemiológicos e clínicos.

Infertility affects approximately 15% of couples in reproductive age and 50% of the cases are directly related to man. The decrease in male fertility is due to several conditions including congenital malformations, genetic and endocrine disorders, infectious and inflammatory diseases, sexual dysfunction and lifestyle. Sperm protein SP22 (22kDa) has been shown to be a male fertility biomarker since, in rats, it is well established that its concentration, in sperm extractions from the epididymal tail, correlates with the fertility of these gametes. However, to incorporate this protein as a fertility biomarker in epidemiological and clinical studies, quantitative data are required in humans. Thus, the present study aimed to standardize the SP22 quantification and immunolocalization technique, investigate possible correlations among conventional and functional seminal parameters of fertile and infertile men with the concentration of this protein and to evaluate its predictive potential as a non-invasive fertility biomarker. Therefore, two observational studies were performed: one case-control type and the other sectional type. The case-control study was carried out on 44 volunteers’s seminal samples from Botucatu city and region, aged between 20 and 50 years, who were placed according to fertility: fertile (one or more children) and infertile. The sectional study was carried out on 12 patients’s attendend by the Human Reproduction Center of the Botucatu Medical School – UNESP, also aged between 20 and 50 years. In both studies were excluded those couples whose female factor of infertility was present. Multiparametric protocols standardization for the spermatozoa functional evaluation by flow cytometry technique, conventional and functional seminal analyzes, quantification and immunolocalization of SP22 were performed. The correlation among some parameters were investigated. This study was approved by Research Ethics Committee of the Botucatu Medical School – UNESP and the individuals included provided written consent. Infertile volunteers exhibited a reduction in volume and total sperm number of ejaculated as well as in volume, sperm concentration and total sperm number of post-swim-up. Both infertile volunteers and infertile patients had a lower percentage of cells with normal morphology. Fast progressive motility was another seminal quality parameter that was shown to be reduced in infertile patients. In addition to changes in some seminal parameters, infertile volunteers also exhibit a reduction in serum concentration of LH. The analyzes of the determination coefficients indicated that the proposed multiparametric protocols are adequate. Although no significant differences were observed between groups regarding functional seminal parameters, damage plasma membrane was positively correlated with superoxide anion production in the mitochondrial matrix. Immunostaining revealed the presence of SP22, among other sites, in the equatorial segment of the sperm head. The concentration determination of SP22, performed to date, was not significantly different between fertile and infertile volunteers and was not correlated with any of the parameters investigated. Therefore, the evaluation of the remaining seminal samples, using affinity purified monoclonal antibodies, which is underway, will be fundamental to complement the present study. However, this is an important intial step in the characterizing of SP22 as a potential non-invasive biomarker predicitve of fertility/infertilty in humans that may support epidemiological and clinical studies
Spermatic correlations and characterization of a potential biomarker of fertility in humans: sperm protein SP22
Keywords: análises seminais convencionais; análises seminais funcionais; espermatozoide humano; citometria de fluxo; biomarcador de fertilidade; SP22; Conventional seminal analyzes; functional seminal analyzes; human spermatozoa; flow cytometry; fertility biomarker