Estudos de caracterização da proteína NPF, um homólogo da proteína p55 de Drosophila, presente em complexos de remodelagem de cromatina em Neurospora crassa em condições de estresse - Orives, Karina Gabrielle Resges [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023)
Torna-se cada vez mais evidente que modificações covalentes introduzidas em cromatinas, tais como a metilação de resíduos de aminoácidos específicos em proteínas histonas, podem afetar profundamente as funções dos genomas de diferentes organismos. O complexo PRC2, composto por proteínas Polycomb, é um regulador que em plantas, animais e fungos, trimetila o resíduo de lisina 27 da histona H3 (H3K27me3), levando a cromatina a um estado transcricional reprimido. Embora ausente nas leveduras, os componentes centrais do complexo PRC2 são bastante conservados e em Neurospora crassa são representados pelas proteínas SET-7, EED, SU(Z)12, e NPF. Utilizando uma abordagem proteômica para encontrar o fator de transcrição modulando negativamente a expressão do gene gsn durante o estresse térmico, nosso grupo encontrou entre vários candidatos, a proteína NPF do complexo PRC2, sugerindo um papel para a mesma na resposta ao estresse térmico. Considerando que a repressão da expressão gênica mediada por H3K27me3 é ainda bastante desconhecida em fungos, e que inicialmente NPF foi descrita estar relacionada ao estresse térmico, aproveitamos o sistema relativamente simples de N. crassa para explorar possíveis relações entre NPF-PRC2 e decifrar algumas das respostas adaptativas do fungo a diferentes formas de estresse. Para isto, analisamos inicialmente o comportamento de uma linhagem do fungo nocauteada no gene npf (Δnpf) após exposição a várias condições estressantes, tais como alta temperatura (45° C), valores de pH ácido (4,5) e alcalinos (7,2 e 7,8), alta osmolaridade (sorbitol e NaCl), agentes oxidantes (menadiona, H2O2 e paraquat) e altas concentrações de íons cálcio, tendo como controle a linhagem mutante genotipicamente recuperada e como background a linhagem selvagem do fungo. Nossos resultados demonstraram que a linhagem Δnfp possui um fenótipo defectivo durante o crescimento vegetativo, tais como uma conidiação reduzida, baixa produção de carotenoides, micélio com hifas bastante ramificadas e extensões encurtadas e uma taxa de extensão de hifas basais tardia. Quando cultivada em pH alcalino, a linhagem mutante apresentou uma redução acentuada no diâmetro da colônia e também um crescimento prejudicado em níveis elevados de íons cálcio, agentes osmóticos (sorbitol e NaCl) e agentes oxidantes (paraquat, menadiona e peróxido de hidrogénio), sugerindo que as vias de regulação de osmolaridade, pH e desintoxicação dos fungos são de alguma forma moduladas por NPF e que esta proteína pode ser um hub para o crosstalk entre as diferentes vias de sinalização. Quando submetida a estresse térmico, a linhagem Δnfp mostrou crescimento radial drasticamente reduzido, que foi acompanhado por uma redução do conteúdo de glicogênio. Considerando os dados da literatura para NPF, esta é a primeira vez que é atribuída a esta proteína um papel no metabolismo de carboidratos e na resposta fúngica ao estresse. Nossos resultados são, portanto, inéditos e indicaram que NPF é importante para as células modularem adequadamente a expressão gênica e responderem aos desafios ambientais em fungos e participarem na resposta adaptativa ao estresse. Se NPF participa diretamente ou não destes eventos e se NPF-PRC2 estão envolvidas em eventos de remodelagem da cromatina, necessita ser melhor investigado, uma vez que o crescimento tardio da Δnfp pode ser devido a um papel desta proteína em outros complexos que não seja o PRC2.

It has become increasingly clear that covalent modifications of chromatin, such as methylation of specific histone residues can have profound effects on genome functions in different organisms. In plants, animals and fungi, the Polycomb proteins complex PRC2 is a regulator that trimethylates Lys27 of histone H3 (H3K27me3), leading to transcriptionally repressed chromatin state. Although absent in yeasts, the core components of PRC2 are conserved in several fungi, including the Neurospora crassa proteins SET-7, EED, SU(Z)12, and NPF. Using a proteomic approach to search for TF downregulating gsn gene transcription under heat stress, our group found among putative candidates, the PRC2 NPF component, suggesting a role for this protein in heat stress response. Considering that repression mediated by H3K27me3 is largely unknown in fungi, and that we previously correlated NPF to heat stress, we took advantage of the relatively simple N. crassa system to explore possible relationships between NPF-PRC2 and stress-adaptative responses. To achieve our goals, growth behavior of a Δnpf strain was analyzed after exposing to stressing conditions, such as heat (45° C), acid (4.5) and alkaline pH values (7.2 and 7.8), osmotic (sorbitol and NaCl), oxidative chemicals (menadione, H2O2, paraquat) and high quantities of calcium, using as control a rescued Δnpf and the wild-type strain as background. The Δnfp strain displayed several phenotypical defects at the vegetative growth condition, as an impaired conidiation, defective carotenoid production, a high branching-hyphae mycelium with a shorten-hyphae extension, and a retarded hyphae extension rate. Mutant cells cultivated at alkaline pH displayed severe colony-diameter reduction, and impaired growth at high levels of calcium ions, osmotic (sorbitol and NaCl) and oxidative chemicals (paraquat, menadione and hydrogen peroxide), suggesting that the high osmolarity, pH and fungi detoxification pathways are somehow modulated by NPF, that might be acting as a hub in a pathway crosstalk. For heat stress, we found for Δnfp a, extreme reduced radial growth and in parallel, a reduction of glycogen content. Despite of literature data, this is the first time that a role in carbohydrate metabolism and stress-response is addressed to NPF. These unpublished results pointed that NPF is important to cells properly modulate gene expression and respond to environmental challenges in fungi and participating in stress-adaptive response. If NPF participates directly or not of these events and if NPF- PRC2-chromatin-remodeling events are also involved, need to be more investigated, since the slow-growth Δnfp can be due to a role of this protein in complexes other than PRC2.
Characterization studies of the NPF protein, a homolog of the of the Drosophila p55 protein, present in chromatin remodeling complexes in Neurospora crassa under stress conditions
Keywords: Neurospora crassa; Cromatina; Regulação de expressão gênica; Estresse; Interação proteína-proteína; Chromatin; Gene expression regulation; Stress; Protein-protein interaction