Síntese, caracterização e ação antimicrobiana de óxidos bimetálicos e de revestimentos depositados à plasma sobre resina acrílica - Foggi, Camila Cristina de [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017)
Devido ao aumento da tolerância dos microrganismos aos antimicrobianos atualmente disponíveis, existe a necessidade de desenvolvimento de métodos alternativos para o controle das infecções. Na primeira etapa dessa pesquisa, óxidos bimetálicos foram sintetizados por meio dos métodos hidrotermal assistido por micro-ondas e co-precipitação, variando-se as condições de síntese, como temperatura, pH, utilização ou não de surfactantes e tipos de solventes. Os diferentes microcristais de tungstato de prata (α-Ag2WO4) e molibdato de prata (β-Ag2MoO4) obtidos foram caracterizados por difração de Raios X (DRX), microscopia eletrônica de varredura por emissão de efeito de campo (MEV-EC), microscopia eletrônica de transmissão (MET), espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX), espectroscopia Raman e mensurações de fotoluminescência (PL) e UV-Vis. A atividade antimicrobiana desses compostos contra células planctônicas de Staphylococcus aureus resistente à meticilina – SARM, Escherichia coli (E. coli) e Candida albicans (C. albicans) foi avaliada por meio da determinação das concentrações inibitórias (CIM) e bactericida/fungicida mínimas (CBM/CFM). Além disso, com base nos testes de CIM, CBM e CFM, os compostos que proporcionaram os melhores resultados (α-Ag2WO4 irradiado e α-Ag2WO4 e β-Ag2MoO4, ambos sintetizados em álcool) foram também avaliados quanto à inibição da formação de biofilmes de SARM, E. coli e C. albicans, através de contagem de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL), determinação do peso seco dos biofilmes e análise por microscopia de varredura confocal a laser (CLSM) e MEV. Outra alternativa para o controle das infecções, avaliada na segunda etapa desta pesquisa, foi a deposição de filmes de prata/dióxido de silício (Ag/SiO2) sobre resina acrílica para base de prótese por meio de copulverização assistida à plasma, utilizando dois tempos de deposição (7 e 15 minutos). Filmes puros de Ag e de SiO2 também foram depositados para comparação e todos foram caracterizados através de DRX, análise de espessura, determinação da rugosidade média, hidrofobicidade e energia livre de superfície (ELS), espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FTIR), MEV-EC e microscopia de força atômica (MFA). A adesão de C. albicans sobre a superfície da resina acrílica, com ou sem revestimento (controle), foi avaliada por meio de contagem de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL), 9 CLSM e MEV-EC. Os resultados das caracterizações de MET e EDX do α-Ag2WO4 irradiado e não-irradiado confirmaram o crescimento de Ag metálica na superfície dos cristais de α- Ag2WO4 irradiados. Todos os microcristais de α-Ag2WO4 e β-Ag2MoO4 analisados apresentaram cristalinidade, sem a presença de fases deletérias, ordem estrutural e simetria a longo (DRX) e curto alcance (Raman). As análises UV-Vis permitiram estabelecer a energia dos gaps ópticos (Egap) que variaram de 2,4 eV a 3,12 eV para o α-Ag2WO4 irradiado e aquele sintetizado em álcool e de 3,29 eV para 3,33 eV para os microcristais de βAg2MoO4 sintetizados em amônia e etanol, respectivamente. As mensurações de PL indicaram maior absorção na região do laranja (613 nm) e do vermelho (750 nm) para o α-Ag2WO4 sintetizado em água, enquanto para aqueles sintetizados em álcool e amônia os picos máximos foram no azul (447 nm). Já para o βAg2MoO4, a maior absorção foi observada na região do azul, sobretudo para os microcristais sintetizados em álcool. Imagens de MEV-EC revelaram que os microcristais de α-Ag2WO4 apresentaram natureza aglomerada, forma de bastões hexagonais alongados, sendo organizados em forma de flores quando sintetizados em amônia e álcool. Para o βAg2MoO4, os microcristais apresentaram formato arredondado e tamanho em escala micrométrica. As imagens também revelaram que, dependendo do solvente utilizado, os microcristais apresentaram diferentes faces cristalográficas: [001], [101] e [010] para o α-Ag2WO4 e [011], [001] e [111] para o βAg2MoO4. Os testes microbiológicos realizados com células planctônicas evidenciaram que todos os microcristais apresentaram atividade antimicrobiana. Entretanto, a CIM/CBM para o SARM foi menor com o α-Ag2WO4 irradiado (31,25 μg/mL) que aquela obtida com o não irradiado (125 μg/mL). Valor intermediário (62,50 μg/mL) foi observado para inativar C. albicans, tanto para o α-Ag2WO4 sintetizado com polivinil pirrolidona (PVP) como para o β-Ag2MoO4 sem PVP, ambos obtidos por co-precipitação. Os valores verificados para os microcristais de α-Ag2WO4 sintetizados em álcool, amônia e água foram, respectivamente, 3,90 μg/mL, 7,81 μg/mL e 7,81 μg/mL para C. albicans, 15,62 μg/mL, 62,50 μg/mL e 125 μg/mL para SARM e 0,48 μg/mL, 0,48 μg/mL e 0,97 μg/mL para E. coli. Para os microcristais de -Ag2MoO4 sintetizados em álcool, amônia e água os valores foram, respectivamente, 7,81 μg/mL, 7,81 g/mL e 15,62 μg/mL para C. albicans, 31,25 μg/mL, 62,50 μg/mL e 500 μg/mL para SARM e 0,49 μg/mL, 1,95 μg/mL e 3,91 μg/mL para E. coli. Nos testes realizados com biofilmes, os três microcristais selecionados (α-Ag2WO4 irradiado, α-Ag2WO4 e βAg2MoO4, ambos sintetizados em álcool) foram capazes de inibir a formação de biofilme de C. albicans nas seguintes concentrações: 15,62 μg/mL, 15,62 μg/mL e 125 μg/mL, respectivamente. As 10 concentrações obtidas para SARM foram, respectivamente, 31,25 μg/mL, 62,50 μg/mL e 250 μg/mL, enquanto para E. coli foram, respectivamente, 1,95 μg/mL, 3,90 μg/mL e 7,81 μg/mL. Os microcristais selecionados, nas mesmas concentrações, também reduziram o peso seco das culturas microbianas dos três microrganismos. As imagens de CLSM e MEV mostraram resultados consistentes entre si e com aqueles obtidos por UFC/mL. Além disso, as análises de MEV indicaram alterações morfológicas, tendo sido mais evidentes para as células de C. albicans e com o α-Ag2WO4 sintetizado em álcool. Os resultados da segunda etapa deste estudo mostraram que não foi possível, com perfilômetro, detectar a espessura dos filmes depositados. Os filmes Ag/SiO27, Ag e SiO2 aumentaram a rugosidade (Ra) da superfície (3,4 μm, 4,2 μm e 4,1 μm, respectivamente), enquanto o filme Ag/SiO215 diminuiu (2,8 μm), em comparação com o controle (PMMA) sem revestimento (3,2 μm). O ângulo de contato com água do PMMA foi de 100,83 (hidrofóbico) enquanto os dos filmes depositados foram menores (Ag/SiO27 = 61,57, Ag/SiO215 = 93,97, Ag = 83,66e SiO2 = 47,01). A ELS do PMMA e dos filmes Ag/SiO215 e Ag foram similares e menores que as dos filmes Ag/SiO27 e SiO2. As imagens de MEV-EC e MFA revelaram a presença de grãos de tamanhos diferentes nos filmes Ag/SiO27 e Ag/SiO2, apresentando uma camada de SiO2 inferior (grânulos pequenos), recoberta com nanopartículas de Ag (grânulos maiores) na superfície. A estrutura dos filmes Ag/SiO27 e Ag/SiO2 apresentou-se na fase amorfa (DRX) e a análise em FTIR demonstrou a presença de picos relacionados com as ligações Si-O e Si-H. As médias de Log10 UFC/mL de C. albicans observadas para os filmes Ag/SiO27, Ag e SiO2 foram semelhantes e não diferentes do controle, porém o filme Ag/SiO215 promoveu redução no número de células viáveis em mais de 2 logs em comparação com o controle. Com base nos resultados obtidos, a atividade antimicrobiana mais efetiva foi observada com os microcristais de α-Ag2WO4 sintetizados em álcool e com o filme Ag/SiO215.

Due to the increased tolerance of the microrganisms to the available antimicrobial drugs, there is a need of development of alternative methods for infection control. In the first part of this study, bimetallic oxides were synthesized by hydrothermal microwave-assisted and coprecipitation methods, varying synthesis conditions, as presence or absence of surfactants and types of solvents used. The different microcrystals of α-Ag2WO4 and β-Ag2MoO4 obtained were characterized by X-ray diffraction (XRD), field-emission scanning electron microscopy (FE-SEM), transmission electron microscopy (TEM), energy diffraction spectroscopy (EDS), Raman spectroscopy and photoluminescence measurements (PL) and UV-Vis. Their antimicrobial activity was evaluated against planktonic cells of methicillin - resistant Staphylococcus aureus - MRSA, Escherichia coli (E. coli) and Candida albicans (C. albicans) by the determination of inhibitory concentrations (MIC) and bactericidal/fungicidal concentrations (MBC/MFC). Based on the MIC, MBC and MFC values, the microcrystals that provided the best results (α-Ag2WO4 irradiated and α-Ag2WO4 and β-Ag2MoO4, both synthesized in alcohol) were also evaluated for their ability to inhibit biofilm of MRSA, E. coli and C. albicans, by counting the CFU/mL, dry weight determination, and analysis using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and FE-SEM. Other method for infection control evaluated in the second part of this research, was the deposition of SiO2/Ag thin films on the surface of an denture base acrylic resin by co-sputtering plasma, using two deposition times (7 and 15 minutes). Pure Ag and SiO2 films were also deposited for comparison and all thin films were characterized by XRD, thickness measurement, roughness determination, hydrophobicity and surface free energy (SFE), Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), SEM and atomic force microscopy (AFM). C. albicans adhesion was evaluated by CFU/mL counting, CLSM and MEV. Results from TEM and EDS confirmed the growth of nanofilaments of metallic Ag on the surface of the irradiated α-Ag2WO4. All microcrystals of α-Ag2WO4 and β-Ag2MoO4 analysed showed crystallinity, without the presence of secondary phases, with structural order and symmetry at short (Raman) and long range (XRD). The band gap values derived from UV–Vis spectra ranged from 2.4 eV to 3.12 eV for the irradiated α- Ag2WO4 and those synthesized in alcohol and from 3.29 eV to 3.33 eV for the microcrystals of β-Ag2MoO4 synthesized in ammonia and ethanol, respectively. PL measurements indicated 12 that the maximum absorption was observed at the orange region (613 nm) and red region (750 nm) for the α-Ag2WO4 synthesized in water, while for those obtained in alcohol and ammonia, the highest peaks were in the blue region (447 nm). For the β-Ag2MoO4, the maximum absorption was seen at the blue region, mainly when the synthesis was performed in alcohol. FE-SEM images revealed that the microcrystals of α-Ag2WO4 showed an agglomerated nature, in the shape of elongated hexagonal nanorods, being organized in flower-like structures when synthesized in ammonia and alcohol. For β-Ag2MoO4, the microcrystals showed were round-shaped, typically in the micrometer size. The microscopic images also revealed that, depending on the solvent used, the microcrystals presented different crystallographic faces: [001], [101] and [010] for the α-Ag2WO4 and [011], [001] and [111] for the β-Ag2MoO4. Microbiological tests performed with planktonic cells showed that all synthesized microcrystals exhibit antimicrobial activity. However, the MIC/MBC value for MRSA for the irradiated α-Ag2WO4 (31.25 μg/mL) was lower that that obtained for the non-irradiated (125 μg/mL). Intermediate value (62.50 μg/mL) was required to inactivate C. albicans, for the α-Ag2WO4 synthesized with PVP and β-Ag2MoO4 without PVP, both obtained by co-precipitation method. The values found for the α-Ag2WO4 microcrystals synthesized in alcohol, ammonia and water were, respectively, 3.90 g/mL, 7.81 g/mL and 7.81 g/mL for C. albicans, 15.62 g/mL, 62.50 g/mL and 125 g/mL for MRSA and 0.48 μg/mL, 0.48 μg/mL and 0.97 μg/mL for E. coli. For the β-Ag2MoO4 microcrystals synthesized in alcohol, ammonia and water the values were, respectively, 7.81 g/mL, 7.81 g/mL e 15.62 g/mL for C. albicans, 31.25 μg/mL, 62.50 μg/mL and 500 μg/mL for MRSA and 0.49 μg/mL, 1.95 μg/mL and 3.91 μg/mL for E. coli. In the tests performed with biofilms, (irradiated α-Ag2WO4, α-Ag2WO4 and β-Ag2MoO4, both synthesized in alcohol) were able to inhibit C. albicans biofilm formation at the following concentrations: 15.62 μg/mL, 15.62 μg/mL and 125 μg/mL, respectively. The concentrations required for MRSA were, respectively, 31.25 μg/mL, 62.50 μg/mL and 250 μg/mL, while for E. coli were, respectively, 1.95 μg/mL, 3.90 μg/mL and 7.81 μg/mL. The selected microcrystals, at the same concentrations, also reduced the dry weight of the biofilms of the three microorganisms. CLSM and SEM images showed results that were consistent with each other and with the data obtained in the CFU/mL assay. In addition, SEM analyses indicated morphological alterations, which were more evident for the C. albicans cells and with the α-Ag2WO4 synthesized in alcohol. The results from the second part of this study showed that it was not possible to detect the thickness of the deposited films. The Ag/SiO27, Ag and SiO2 thin films 13 increased the surface roughness (Ra) (3.4 μm, 4.2 μm and 4.1 μm, respectively), whereas the Ag/SiO2 decreased (2.8 μm), in comparison to control, (PMMA) without coating (3.2 μm). The water contact angle of the PMMA was 100.83 (hydrophobic) while those of the deposited films were lower (Ag/SiO27 = 61.57, Ag/SiO2 = 93.97, Ag = 83.66e SiO2 = 47.01). The SFE of the PMMA and the films Ag/SiO215 and Ag were similar and lower than those of the films Ag/SiO27 and SiO2. FE-SEM and MFA revealed the presence of grains with different sizes in the films Ag/SiO27 and Ag/SiO215 , showing a base layer of SiO2 (small granules), covered by Ag nanoparticles (bigger grains) in the surface. The structures of the Ag/SiO27 and Ag/SiO2 films were in the amorphous state (XRD) and FTIR analysis demonstrated the presence of peaks related to Si-O and Si-H bonds. The mean values of Log10 CFU/mL of C. albicans observed for the Ag/SiO27, Ag and SiO2 were similar and not different from the control, but the Ag/SiO2 film promoted a reduction in the number of viable cells more than 2 logs compared to control. Based on the obtained results, the more effective antimicrobial activity was observed for the α-Ag2WO4 microcrystals synthesized in alcohol and for the Ag/SiO215 thin film.
Synthesis, characterization and antimicrobial action of bimetallic oxides and thin films deposited by plasma on acrylic resin
Keywords: Antibacterianos; Candida albicans; Escherichia coli; Staphylococcus aureus resistente à meticilina; Polimetil metacrilato; Prótese parcial removível; Anti-bacterial agents; Candida albicans; Escherichia coli; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Polymethyl methacrylate; Removable partial denture