Purificação e imobilização de β-glicosidase do fungo Thermoascus aurantiacus em criogéis supermacroporosos - Mól, Paula Chequer Gouveia [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021)
As β-glicosidases são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas β-(1,4) terminais, função essencial a muitos processos biológicos, sendo, portanto, de grande interesse para a bioquímica e a biotecnologia. Este trabalho teve como objetivo a obtenção e o posterior estudo da purificação e imobilização da β-glicosidase do fungo termofilico Thermoascus aurantiacus em suportes supermacroporosos de poliacrilamida produzidos em condições de congelamento (conhecidos como criogel). A enzima foi produzida por fermentação em estado sólido utilizando sabugo de milho como substrato. A primeira coluna utilizada (Capítulo II) foi obtida por modificação química do criogel pela introdução dos grupos iônicos 2-(dimetilamino)etil metacrilamida (DMAEMA). Os experimentos de adsorção foram realizados em diferentes valores de pH e os resultados de rendimento (%) e fator de purificação foram calculados e submetidos a ANOVA a 95% de significância. O pH teve efeito significativo (p<0,05) no rendimento, sendo que o melhor resultado foi obtido em pH 5,0 (82%). O fator de purificação não variou e os resultados foram considerados baixos uma que vez que a eluição utilizada foi isocrática (1,25-1,33). Entretanto, por meio de SDS-PAGE verificou-se que o extrato bruto foi parcialmente purificado, independentemente do valor de pH. A segunda coluna sintetizada (Capítulo III) foi obtida pela incorporação do aminoácido L-fenilalanina na superfície do criogel, e utilizada em testes de imobilização de β-glicosidase via interação hidrofóbica. A adsorção foi inicialmente estudada em função do pH e verificou-se que o maior fator de purificação foi obtido em pH 3,0. Em seguida, o efeito da temperatura e da forca iônica de diferentes soluções salinas na adsorção e consequentemente na atividade da enzima imobilizada foi avaliado. Além disso, a reutilização do biocatalisador foi investigada por sete ciclos consecutivos e não foi observado decréscimo na sua atividade específica. Nos dois casos, as colunas de criogéis produzidos foram caracterizadas em termos de suas propriedades morfológicas e hidrodinâmicas. Os resultados obtidos no trabalho mostram que os criogéis produzidos podem ser um potencial meio de separação e imobilização de proteínas.

β-glucosidases are enzymes that hydrolyze terminal β-(1,4) glycosidic bonds, an essential function to many biological processes, that is of great interest in biochemistry and biotechnology. The purpose of this study encompasses the obtaining and posterior purification and immobilization studies of β-glucosidase from thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus in supermacroporous supports of polyacrylamide produced in freezing conditions (knows as cryogel). The enzyme was produced by solid state fermentation using corn cob as substrate. The first cryogel column used (Chapter II) was obtained by chemical modification of the cryogel by the introduction of the ionic groups 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate. The adsorption experiments were carried out in different pH conditions and the results of yield (%) and purification factors were calculated and submitted to ANOVA at 95% of significance level. The efficiency was considerably affected (p<0.05) by the pH and the best result was achieved at pH 5.0 (82%). Purification factors did not vary and the results were low since isocratic elution was performed (1.25-1.33). However, SDS-PAGE was also realized to investigate purity and it was verified that the crude extract was partially purified, regardless of the pH. The second column synthetized (Chapter III) was obtained by the incorporation of the aminoacid L-phenylalanine on the cryogel surface and was used in β-glucosidase immobilization tests via hydrophobic interaction. The adsorption was initially studied as a function of the pH and the highest purification factor was found at pH 3.0. Then, the effect of the temperature and ionic strength of different saline solutions on adsorption and consequently on the activity of the immobilized enzyme was evaluated. In addition, the reuse of the biocatalyst was investigated for seven consecutive cycles and no decrease on its the specific activity was observed. In both cases, the cryogel columns produced were characterized in terms of their morphological and hydrodynamic properties. The results obtained in this work show that the cryogels produced can be potential supports of protein separation and immobilization.
Purification and immobilization of β-glucosidase from the fungus Thermoascus aurantiacus in supermacroporous cryogel
Keywords: β-glicosidase; Adsorção; Criogel; Interação hidrofóbica; Troca iônica; β-glucosidase; Adsorption; Cryogel; Ion exchange; Hydrophobic interaction