Study of genes stimulated by interferon-τ in immune cells as candidates for pregnancy markers in bovine females - Feltrin, Isabella Rio [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024)
Nas fêmeas bovinas, as perdas embrionárias ocorridas entre o 14º e o 19º dia após o estro afetam significativamente a eficiência reprodutiva dos rebanhos. Portanto, o desenvol-vimento de métodos diagnósticos capazes de detectar precocemente a gestação ou não gestação é um ponto importante para melhorar o desempenho reprodutivo dos bovinos. O interferon-τ (IFN-τ) produzido pelo concepto desempenha um papel importante du-rante o reconhecimento materno da prenhez (MPR) em ruminantes, que envolve mais do que a inibição dos pulsos luteolíticos da prostaglandina F2 alfa (PGF2α) para manter a funcionalidade do corpo lúteo (CL). Para uma prenhez bem-sucedida, o concepto semi-alogênico deve evitar a sua rejeição pelo sistema imunológico materno, destacando a importância de elucidar os mecanismos envolvidos durante o início da prenhez. Além disso, neste momento, o IFN-τ é liberado na circulação sanguínea e estimula a expressão de genes (ISGs). O estudo da expressão gênica dos ISGs clássicos (ISG15, OAS1, MX1 e MX2) em células imunes do sangue periférico, como células mono (PBMC) e polimor-fonucleares (PMN) já vem sendo utilizado como ferramenta de diagnóstico precoce da prenhez, porém apresentou baixa acurácia. Neste contexto, nossos objetivos neste estudo foram: 1) caracterizar a magnitude da resposta dos ISGs clássicos (ISG15) e não clássi-cos (RSAD2 e IFI44); bem como o perfil das citocinas pró- (IL1β) e anti-inflamatórias (IL10) em PBMC e PMN estimuladas com IFN-τ (Experimento 1) ou lavados uterinos (UF) de vacas gestantes (Experimento 2); e 2) avaliar a acurácia desses biomarcadores recentemente identificados (RSAD2 e IFI44) como preditores da prenhez precoce em fêmeas bovinas (Experimento 3). Nos Experimentos 1 e 2, PBMC e PMN foram isola-das do sangue de vacas Nelore não gestantes (N=9) entre 10-12 dias pós-ovulação (D0 = dia da ovulação), e estimuladas com 100 ng/mL de roIFNT ou UF de vacas no dia 18 de gestação. A expressão gênica foi determinada por qPCR. Para o Experimento 3, fêmeas Nelore (nulíparas, N=103; primíparas, N=53; pluríparas, N=91) foram submetidas à cole-ta de sangue para isolamento das PMN, e foi realizada ultrassonografia Doppler para avaliar a funcionalidade do CL no D20 após inseminação artificial em tempo fixo (D0 = dia da IATF). A expressão gênica também foi determinada por qPCR. Além disso, fo-ram realizadas curvas ROC para determinar a acurácia dos preditores da prenhez no D20 (ISGs e Doppler). Nos Experimentos 1 e 2, a expressão de todos os ISGs foi maior (P<0,05) em ambas as células tratadas com roIFNT e UF-Conceptus do que nos grupos Controle. O fold change indicou que o ISG15 e RSAD2 foram os genes mais estimula-dos (P<0,05) em PBMC e PMN. A expressão de IL1β foi menor (P<0,05) em PBMC e PMN tratadas com UF-Conceptus; no entanto, nenhuma diferença (P>0,1) foi observa-da entre os outros grupos de tratamento. Para o Experimento 3, todas as combinações genéticas foram testadas, e a melhor associação para aumento da acurácia (92,7%) e re-dução de resultados falsos negativos (0,9%, 2/233) foi obtida quando os animais foram considerados prenhes se um dos os quatro ISGs (ISG15, OAS1, RSAD2 e IFI44) foram estimulados em fêmeas com CL ativo (> 25% de perfusão sanguínea) no D20. Conclu-indo, o ISG15 e RSAD2 foram os ISGs mais estimulados em PBMC e PMN, indicando que uma associação entre ISGs clássicos e não clássicos pode ser utilizada como uma ferramenta precoce para melhorar a predição da prenhez no D20 em fêmeas bovinas com CL ativo determinado através da US-Doppler.

In bovine females, embryonic losses occurring between the 14th and 19th day after es-trus significantly affect the reproductive efficiency of herds. Therefore, the develop-ment of diagnostic methods capable of early detection of pregnancy or non-pregnancy is an important point for improving the reproductive performance of cattle. Interferon-τ (IFN-τ) produced by the conceptus plays an important role during maternal recognition of pregnancy (MPR) in ruminants, which involves more than the inhibition of luteolytic pulses of prostaglandin F2 alpha (PGF2α) to maintain the function of corpus luteum (CL). For a successful pregnancy, the semi-allogeneic conceptus must avoid rejection by the maternal immune system, highlighting the importance of elucidating the mechanisms involved during early pregnancy. Furthermore, at this moment, IFN-τ is released into the blood circulation and stimulates the expression of genes (ISGs). The study of gene ex-pression of the classic ISGs (ISG15, OAS1, MX1, and MX2) in peripheral blood immune cells, such as mono (PBMC) and polymorphonuclear (PMN) cells has already been used as a form of early diagnosis of pregnancy, but showed low accuracy. In this context, our objective were: 1) characterize the response magnitude of classic (ISG15) and non-classic (RSAD2 and IFI44) ISGs; as well as pro- (IL1β) and anti-inflammatory (IL10) cytokines in PBMC and PMN stimulated by IFN-τ (Experiment 1) or uterine flush (UF) from pregnant cows (Experiment 2); and 2) evaluate the accuracy of these recently identified biomarkers (RSAD2 and IFI44) as early pregnancy predictors in bovine fe-males (Experiment 3). In the Experiment 1 and 2, PBMC and PMN were isolated from the blood of non-pregnant Nelore cows (N=9) between 10-12 days post-ovulation (D0 = day of ovulation) and stimulated with 100 ng/mL of roIFNT or UF from day 18 of pregnancy cows. Gene expression was determined by qPCR. For the Experiment 3, Nelore females (nulliparous, N=103; primiparous, N=53; pluriparous, N=91) were sub-mitted to blood collection for PMN isolation, and Doppler ultrasonography was per-formed to assess the functionality of the corpus luteum (CL) on D20 after timed-artificial insemination (D0 = TAI day). Gene expression was also determined by qPCR. In addition, ROC curves were performed to determine the accuracy of pregnancy pre-dictors on D20 (ISGs and Doppler). In Experiments 1 and 2, expression of all ISGs was greater (P<0.05) in both cells treated with roIFNT and UF-Conceptus than its controls. The fold change indicated that ISG15 and RSAD2 were the most stimulated genes (P<0.05) in PBMC and PMN. Expression of IL1β was lesser (P<0.05) in PBMC and PMN treated with UF-Conceptus; however, no difference (P>0.1) was observed be-tween the other treatment groups. For the Experiment 3, all gene combinations were tested, and the best association for an increase in accuracy (92.7%) and reduction of false negative results (0.9%, 2/233) was obtained when pregnant animals were consid-ered if one of the four ISGs (ISG15, OAS1, RSAD2, and IFI44) were stimulated in fe-males with an active CL (> 25% blood perfusion) on D20. In conclusion, ISG15 and RSAD2 were the most stimulated ISGs in PBMC and PMN, indicating that an associa-tion between classic and non-classic ISGs can be used as an early tool to improve preg-nancy prediction at D20 in bovine females with active CL determined by US-Doppler.
Estudos de genes estimulados por interferon-τ em células imunes como candidatos a marcadores de prenhez em fêmeas bovinas
Keywords: ISG; Immune cells; Interferon-τ; Uterine flush; Pregnancy diagnosis