Melhoramento da produção de ramnolipídio através de mutagênese induzida por luz ultravioleta em Pseudomonas aeruginosa - Neves, Raphael Culim [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021)
Biossurfactantes são metabólitos secundários que apresentam uma série de propriedades de superfície, podendo ser usado em diferentes processos industriais, tais como, a produção de fármacos, cosméticos, diversos compostos químicos, bem como pode ser usado como remediador ambiental de locais degradados e poluídos. No entanto, a maior vantagem dos biossurfactantes em relação com os surfactantes químicos é a sua baixa toxicidade e fácil degradação no meio ambiente. O obstáculo para o uso em larga escala dos biossurfactantes é o custo de produção, sendo extremamente maior que os surfactantes de origem química. O objetivo desse trabalho foi verificar a produção do ramnolipídio por mutantes de Pseudomonas aeruginosas usando luz ultravioleta como agente mutagênico, tendo como fonte de carbono o glicerol bruto. As linhagens com maior produção do metabólito serão selecionadas e armazenadas para um possível uso posterior na ciência. A metodologia usada no trabalho foi composta primeiramente pela indução de mutações na cepa LBI 2A1 de Pseudomonas aeruginosa, seguida pela coleta dos clones sobreviventes à radiação. Em seguida as cepas mutantes obtidas passaram pelo teste do Blue-Agar, que tem como finalidade identificar a produção de glicolipídeos, uma vez positivas no teste, os clones aptos seguiram para realização de cultivos em meio contendo glicerol como única fonte de carbono para aferir sua potencialidade de biossíntese de ramnolipídios. As fermentações ocorreram em tubos de ensaio de 25mL, contendo um volume total de 5mL de caldo fermentativo, o qual continha uma concentração de 50g/L de glicerol bruto. As fermentações ocorreram com 30 clones bacterianos diferentes, sendo que, inicialmente foram coletadas 96 variantes. Os resultados desses processos foram divididos em três grupos distintos, sendo eles, a produção de ramnolipídio, o consume da fonte de carbono e a produção de biomassa bacteriana. Para a análise dos resultados, foi usado Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) o qual aferiu a quantidade total de ramnolipídio na amostra, bem como foi usado para identificar a concentração final da fonte de carbono, obtendo assim, o consumo real por cada cepa bacteriana. Já a biomassa foi aferida através do peso seco do pellet de células contido em cada amostra. Os resultados obtidos mostram uma maior capacidade produtiva de ramnolipídio na cepa C1, a qual produziu 0,187g/L o que representa um valor 12% maior em relação à controle (LBI 2A1). No consumo da fonte de carbono, a cepa B2 foi a maior consumidora, degradando 31,38g/L das 50g/L inicialmente presentes, sendo esse resultado muito próximo a das cepas C1 (31,28 g/L) e C2 (31,34 g/L). Em relação a produção de biomassa bacteriana, a linhagem que se destacou foi a C7, com 10,04g/L produzidas, enquanto que a LBI 2A1 obteve 6,44g/L. Apresentado os resultados, pode-se afirmar que houve uma melhora significativa na produção de ramnolipídios pela linhagem C1, a qual obteve resultados consistentes durante o processo fermentativo. O provável mecanismo relacionado a essa melhora provavelmente é em relação a genes chave da rota metabólica do ramnolipídio, no entanto, ainda há necessidade de estudos futuros para compreensão completa dos resultados.

Biosurfactants are secondary metabolites that present a series of surface properties and can be used in different industrial processes, such as the production of drugs, cosmetics, various chemical compounds, as well as being used as an environmental remedy for degraded and polluted places. However, the biggest advantage of biosurfactants over chemical surfactants is their low toxicity and easy degradation in the environment. The obstacle to the large-scale use of biosurfactants is the cost of production, which is extremely higher than surfactants of chemical origin. The aim of this work was to verify the production of ramnolipid by Pseudomonas aeruginosas mutants using ultraviolet light as a mutagenic agent, with the raw glycerol as a carbon source. The strains with the highest production of the metabolite will be selected and stored for possible later use in science. The methodology used in the study was mainly composed of the induction of mutations in the LBI 2A1 strain of Pseudomonas aeruginosa, followed by the collection of clones surviving radiation. Then, as mutant strains passed the Blue-Agar test, which has the ability to identify the production of glycolipids, once positive in the test, the apt clones went on to perform cultures in medium containing glycerol as the only carbon source to assess their potential for ramnolipid biosynthesis. The fermentations took place in 25mL test tubes, containing a total volume of 5mL of fermentation broth, which contained a concentration of 50g / L of crude glycerol. Fermentations occurred with 30 different bacterial clones, and 96 variants were collected. The results of these processes were divided into three distinct groups, namely, the production of ramnolipid, the consumption of the carbon source and the production of bacterial biomass. For the analysis of the results, High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used which measured the total amount of ramnolipid in the sample, as well as it was used to identify the final concentration of the carbon source, thus obtaining the actual consumption for each strain bacterial. Biomass was measured using the dry weight of the cell pellet contained in each sample. The results obtained show a higher productive capacity of ramnolipid in the C1 strain, which produced 0.187g / L, which represents a 12% higher value compared to the control (LBI 2A1). In the consumption of the carbon source, the B2 strain was the biggest consumer, degrading 31.38g / L of the 50g / L initially present, this result being very close to that of the C1 (31.28 g / L) and C2 (31, 34 g / L). Regarding the production of bacterial biomass, the lineage that stood out was C7, with 10.04g / L produced, while LBI 2A1 obtained 6.44g / L. After presenting the results, it can be said that there was a significant improvement in the production of ramnolipids by the C1 strain, which obtained consistent results during the fermentation process. The probable mechanism related to this improvement is probably related to key genes of the metabolic route of ramnolipid, however, there is still a need for future studies to fully understand the results.
Improvement of rhamnolipid production through ultraviolet light-induced mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa
Keywords: Biossurfactantes; Pseudomonas aeruginosa; Ramnolipídio; Mutantes; Radiação ultravioleta; Glicerol; Biosurfactants; Ramnolipid; Mutants; Ultraviolet radiation; Glycerol