Propriedades microbiológicas e indutoras de mineralização de flavonoides isolados ou carreados em hidrogéis termorreversíveis para aplicação como medicação endodôntica - Braga, Gabriela Pacheco de Almeida [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022)
Este trabalho foi dividido em dois capítulos que apresentaram como objetivo: 1) avaliar a ação antibiofilme e citotoxicidade de hidrogéis termorreversíveis de poly-n-vinylcaprolactama (PNVCL) carreados com flavonoides e 2) avaliar o efeito de flavonoides isolados ou incorporados em hidrogéis de PNVCL sobre a viabilidade e na indução de marcadores de mineralização em células odontoblastóides. No capítulo 1 foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e a concentrações bactericidas mínimas (CBM) dos flavonoides ampelopsina (AMP), isoquercitrina (ISO) e rutina (RUT) sobre Streptococcus mutans, Enterococcus faecallis, Actinomyces israelli, Lactobacillus casei e Fusobacterium nucleatum. O flavonoide que obteve os menores valores de CIM/CBM foi avaliado quanto a toxicidade em fibroblastos e foi incorporado em hidrogel de PNVCL para análises posteriores. A síntese do hidrogel de PNVCL foi realizada a partir da polimerização radicalar dos monômeros N-vinilcaprolactama e acetato de vinilae sua caracterização por transmitância e ensaios de liberação dos compostos. Como controles positivos foram avaliados hidrogéis de PNVCL contendo clorexidina (CHX) e hidróxido de cálcio (HC) e controle negativo o hidrogel de PNVCL sem antimicrobianos. Os hidrogéis de PNVCL, PNVCL+AMP, PNVCL+CHX, PNVCL+HC foram avaliados quanto ao seu efeito sobre biofilmes multiespéciespor microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) e por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os extratos dos hidrogéis foram coletados após 48h e 7 dias em meio de cultura e avaliadosquanto a toxicidade sobre os fibroblastos L-3T3 por meio do ensaio colorimétrico com resazurina. Os resultados do capítulo 1 mostraram que AMP apresentou os menores valores de CIM/CBM contra os microrganismos avaliados e reduziu o metabolismo das células L-3T3 em concentrações acima de 0,125 mg/mL. A análise de MEV mostrou que PNVCL+AMP causou redução bacteriana significativa e desorganização do biofilme multiespécie, similar ao obervado para o PNVCL+CH. Na análise de MCVL, PNVCL+AMP levou à significativa redução das células bacterianas viáveis no interior dos túbulos dentinários, superior aos demais grupos. Baseado nos resultados do capítulo 1, conclui-se que dentre os flavonóides testados, AMP apresentou o melhor efeito antimicrobiano e quando incorporada no hidrogel de PNVCL mostrou ação contra os biofilmes multiespécies avaliados, com efeito superior ou semelhante ao PNVCL+CH. No capítulo 2, células odontoblastóides (MDPC-23) foram tratadas com flavonoides AMP, ISO e RUT, em três concentrações diferentes (100 µM, 50 µM e 25 µM) e avaliada sua citotoxicidade em 48 h, 8 dias e 14 dias. Após 48h de tratamento e trocas de meio osteogênico por 8 e 14 dias, foram determinadas a atividade de fosfatase alcalina (ALP), produção de proteína total (PT) e deposição de nódulos mineralizados (NM). Osresultados mostraram que AMP, ISO e RUT não afetaram a viabilidade celular em nenhum dos períodos avaliados. A atividade de ALP foi superior ao controle meio osteogênico quando MDPC-23 foram tratadas com AMP a 100 e 50 µM, ISO a 50 µM e RUT a 100 µM. Maior deposição de NM em comparação ao controle foi observada nas concentrações 100 a 25 µM para AMP, 25 µM para ISO e entre 100 e 25 µM para RUT. Após 48 h de exposição, os extratos de 48 h de PNVCL+AMP e de PNVCL+HC, independente da diluição, não afetaram a viabilidade das células, o que não foi observado para os extratos de 7 dias, que causaram citotoxicidade entre as diluições 1/2 e 1/8. Após 8 e 14 dias de exposição, somente os extratos de 7 dias dos hidrogéis causaram redução da viabilidade celular, porém, não diferiram entre si. A atividade de ALP foi superior ao controle para os extratos de 48 h e 7 dias de PNVCL+AMP e PNVCL+HC, independente da diluição. Para a produção de NM, efeito superior de ambos os extratos (48 h e 7 dias) de PNVCL+AMP foi observado em comparação ao PNVCL+HC. A partir dos resultados do capítulo 2, pode-se concluir que a AMP isolada ou incorporada ao hidrogel de PNVCL apresentou citocompatibilidade e capacidade de induzir marcadores de mineralização em células odontoblastóides. Este estudo demonstrou que AMP carreada em hidrogel de PNVCL apresentou efeito antibiofilme e capacidade de estimular marcadores de mineralização dentinária, propriedades interessantes para aplicação como medicação intracanal.

This dissertation was divided into two chapters that aimed to: 1) evaluate the antibiofilm action and cytotoxicity of thermoreversible poly-n-vinylcaprolactam hydrogels (PNVCL) containing flavonoids and 2) evaluate the effect of flavonoids alone or incorporated in PNVCL hydrogels on the viability and induction of mineralization markers in odontoblast-like cells. In chapter 1, the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) and Minimum Bactericidal Concentrations (MBC) of the flavonoids ampelopsin (AMP), isoquercitrin (ISO) and rutin (RUT) were determined on Streptococcus mutans, Enterococcus faecallis, Actinomyces israelli, Lactobacillus casei and Fusobacterium nucleatum. The flavonoid that had the lower MIC/MBC values was evaluated for fibroblast toxicity and was incorporated into PNVCL hydrogel for further analysis. The synthesis of the PNVCL hydrogel was carried out from the radical polymerization of the monomers N-vinylcaprolactam and vinyl acetate and its characterization by transmittance and release assays of the compounds. As positive controls were evaluated PNVCL hydrogels containing chlorhexidine (CHX) or calcium hydroxide (CH) and PNVCL hydrogel without antimicrobials as negative control. PNVCL, PNVCL+AMP, PNVCL+CHX, PNVCL+HC hydrogels were evaluated for their effect on multispecies biofilms by confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning electron microscopy (SEM). The hydrogel extracts were collected after 48h and 7 days in culture medium and evaluated for toxicity on L-3T3 fibroblasts by colorimetric assay with resazurin. The results of chapter 1 showed that AMP presented the lowest MIC/MBC values against the evaluated microorganisms and reduced the metabolism of L-3T3 cells at concentrations above 0.125 mg/mL. SEM analysis showed that PNVCL+AMP caused significant bacterial reduction and disorganization of the multispecies biofilm, similar to what was observed for PNVCL+CH. CLSM analysis demonstrated that PNVCL+AMP led to a significant reduction of viable bacterial cells inside the dentinal tubules, higher than the other groups. Based on the results of chapter 1, it is concluded that among the flavonoids tested, AMP showed antimicrobial activity and effect against multispecies biofilms when incorporated into the PNVCL hydrogel, and this effect was superior or similar to PNVCL+CH. In chapter 2, odontoblastoid cells (MDPC-23) were treated with flavonoids AMP, ISO and RUT at three different concentrations (100 µM, 50 µM and 25 µM) and their cytotoxicity was evaluated at 48 h, 8 days and 14 days. After 48 h of treatment and changes of osteogenic medium for 8 and 14 days, alkaline phosphatase (ALP) activity, total protein production (PT) and mineralized nodule deposition (NM) were determined. The results showed that AMP, ISO and RUT did not affect cell viability in any of the periods evaluated. ALP activity was superior to the osteogenic medium control when MDPC-23 were treated with AMP at 100 and 50 µM, ISO at 50 µM and RUT at 100 µM. Higher NM deposition compared to the osteogenic control medium was observed at concentrations 100 to 25 µM for AMP, 25 µM for ISO and between 100 and 25 µM for RUT. After 48 h of exposure, the 48 h extracts of PNVCL+AMP and PNVCL+HC, regardless of dilution, did not affect the viability of MDPC-23 cells, which was not observed for the 7 days extracts, which caused cytotoxicity between 1/2 and 1/8 dilutions. After 8 and 14 days of exposure, only the 7 days extracts of the hydrogels caused a reduction in cell viability, but they did not differ from each other. The ALP activity was superior to the control for the 48 h and 7 days extracts of PNVCL+AMP and PNVCL+CH, regardless of the dilution. For NM production, a higher effect of both (48 h and 7 days) extracts of PNVCL+AMP compared to PNVCL+CH. From the results of chapter 2, it can be concluded that AMP alone or incorporated into the PNVCL hydrogel showed cytocompatibility and the ability to induce mineralization markers in odontoblastoid cells. In general, this study demonstrated that AMP carried in PNVCL hydrogel presents antibiofilm effect and the ability to stimulate dentinal mineralization markers, interesting properties for application as intracanal medication.
Microbiological and inducing properties mineralization of flavonoids isolated or loaded in thermoreversible hydrogels for application as medication endodontic
Keywords: Flavonoides; Anti-infecciosos; Biofilmes; Células cultivadas; Hidrogéis; Fosfatase alcalina; Flavonoids