Desenvolvimento de um protocolo de sequenciamento de nova geração do genoma mitocondrial para identificação de Eimeria spp. em galinhas domésticas - Dumalakas, Guilherme Zaratin [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025)
O objetivo deste estudo foi desenvolver um método de sequenciamento de nova geração (NGS) visando o genoma mitocondrial, para detecção e identificação de Eimeria spp. em amostras fecais de galinhas domésticas. O protocolo de PCR foi padronizado usando primers gênero-específicos que anelam em sequências da região putativa do rRNA (primer senso) e do citocromo B (primer antisenso), no genoma mitocondrial de Eimeria spp. Os amplicons da PCR foram analisados por NGS realizado na plataforma Illumina MiSeq, de acordo com o protocolo de metagenômica 16S da Illumina (Illumina, 2013), com leituras de 150 bp e usando o kit MiSeq™ V2 (Illumina). Após a padronização, o protocolo de NGS foi validado pela análise de 91 amostras de DNA extraídas de amostras fecais de galinhas domésticas criadas em granjas comerciais de frangos de corte (CBCF) ou em sistemas alternativos de produção de aves (APPS), previamente examinadas para a presença de Eimeria spp. por NGS de amplicons do gene 18S rRNA. O NGS identificou Eimeria spp. na seguinte ordem de prevalência: 1) CBCFs: Eimeria maxima (44/45; 98%); Eimeria acervulina (39/45; 87%); Eimeria tenella (13/45; 29%); Eimeria mitis (6/45; 13%); e Eimeria praecox (5/45; 11%). 2) APPS: E. mitis (27/46; 59%); E. acervulina (23/46; 50%); Eimeria nagambie (18/46; 39%); E. maxima (13/46; 28%); E. praecox (11/46; 23%); Eimeria lata (10/46; 22%); E. tenella (9/46; 20%); Eimeria brunetti (8/46; 17,4%); Eimeria zaria (7/46; 15%); Eimeria sp. (6/46; 13%); e Eimeria necatrix (6/46; 13%). A identificação das dez espécies de Eimeria da galinha doméstica, juntamente com uma nova unidade taxonômica operacional (OTU) de Eimeria, demonstra que o NGS detecta e diferencia com sucesso as espécies e novas OTUs de Eimeria em amostras fecais de galinhas, o que é essencial para estabelecer medidas de controle para a coccidiose na indústria avícola.

This study aimed to develop a next generation sequencing (NGS) method for sequencing amplicons produced via PCR that targets the mitochondrial genome, allowing the detection and identification of Eimeria spp. in fecal samples from domestic chickens. A PCR protocol was standardized using genus-specific primers that anneal to putative rRNA (forward primer) and cytochrome B (reverse primer) sequences withing the mitochondrial genome of Eimeria spp. PCR amplicons were analyzed using NGS on the Illumina MiSeq platform according to the Illumina 16S metagenomic protocol (Illumina, 2013), with 150 bp paired-end reads and a MiSeq™ Reagent kit v2 (Illumina). Following assay standardization, next generation sequencing was validated through the analysis of 91 DNA samples extracted from fecal samples of domestic chickens raised in commercial broiler chicken farms (CBCF) or alternative poultry production systems (APPS), which had previously been examined for the presence of Eimeria spp. by NGS of 18S rRNA gene amplicons. The NGS identified Eimeria spp. in the following order of prevalence.: 1) CBCFs: Eimeria maxima (44/45; 98%); Eimeria acervulina (39/45; 87%); Eimeria tenella (13/45; 29%); Eimeria mitis (6/45; 13%); and Eimeria praecox (5/45; 11%). 2) APPS: E. mitis (27/46; 59%); E. acervulina (23/46; 50%); Eimeria nagambie (18/46; 39%); E. maxima (13/46; 28%); E. praecox (11/46; 23%); Eimeria lata (10/46; 22%); E. tenella (9/46; 20%) Eimeria brunetti (8/46; 17.4%); Eimeria zaria (7/46; 15%); Eimeria sp. (6/46; 13%); and Eimeria necatrix (6/46; 13%). The identification of the ten Eimeria species of domestic chickens, along with a novel Eimeria operational taxonomic unit (OTU), demonstrates that NGS successfully detects and differentiates Eimeria species and new OTUs from domestic chicken fecal samples, which is essential for establishing control measures for coccidiosis in the poultry industry.
Development of a next generation sequencing protocol targeting the mitochondrial gene for the identification of Eimeria spp. in domestic chickens
Keywords: Avicultura; Cocciodiose; Diagnóstico Molecular; Coccidiosis; Molecular diagnosis; Poultry farming