Identificação de fatores de transcrição de Neurospora crassa envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio - Gonçalves, Rodrigo Duarte [UNESP] (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2008)
Este trabalho teve como objetivo identificar fatores de transcrição envolvidos na via metabólica do glicogênio no fungo Neurospora crassa durante o crescimento vegetativo e na condição de choque térmico. Para isso foi utilizado uma coleção de 139 linhagens mutantes do fungo, as quais possuem genes codificadores de fatores de transcrição individualmente nocauteados. O conteúdo de glicogênio de todas as linhagens foi determinado tanto a 30ºC, temperatura fisiológica de crescimento, quanto a 45ºC, situação de choque térmico. Do total das linhagens analisadas, 10 apresentaram um perfil distinto daquele observado na selvagem. Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição identificados na expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que do total de linhagens analisadas, 3 apresentaram diferenças na transcrição de gsn, sugerindo que os fatores de transcrição nocauteados nestas linhagens atuam diretamente na regulação da transcrição do gene. As linhagens mutantes selecionadas foram avaliadas quanto ao crescimento e comparadas à linhagem selvagem. Todas as linhagens selecionadas apresentaram uma taxa de crescimento bastante semelhante à linhagem selvagem, exceto a linhagem FGSC011062 (ORF NCU09739), a qual apresentou uma taxa de crescimento muito reduzida. Ferramentas de bioinformática disponíveis na internet foram utilizadas para a dedução teórica das características bioquímicas, moleculares e estruturais dos fatores de transcrição selecionados, tais como ponto isoelétrico, massa molecular, sinais de localização nuclear clássicos e a presença de domínios conhecidos. A análise por Blastp revelou que apenas 2 das 10 ORFs selecionadas codificam fatores de transcrição com função conhecida e as demais codificam proteínas hipotéticas...

The objective of this work was to identify transcription factors involved in the glycogen metabolic pathway of the fungus Neurospora crassa. We used a collection of 139 mutant strains, in which each strain has a gene codifying for transcription factor individually knockedout. The glycogen content was quantified during the vegetative growth (30ºC), and after a stress condition such as heat shock (transfer for 30ºC to 45ºC). Of all analyzed strains, 10 showed a pattern of glycogen accumulation distinct of the one observed for the wild type strain. To verify the involvement of the transcription factors identified in the expression of the gene encoding glycogen synthase (gsn), Northern blot experiments were performed and revealed that 3 strains showed differences in gene transcription, either before or after heat shock. The results suggested that the transcription factors knocked-out in the strains might act directly in the regulation of the gsn gene transcription. The growth of the selected mutant strains was evaluated and compared to the wild type strain. Most of the selected mutant had a growth rate similar to the wild type strain, except the strain FGSC01162 (ORF NCU09739), which showed a reduced growth rate. Online bioinformatics tools were used to predict the biochemical parameters, such as isoeletric point and molecular weight, as well protein domain, such as classic nuclear localization signal (cNLS). Analysis by Blastp revealed that 2 from 10 selected ORFs codify transcription factors having functional roles in public databases: the ORF NCU08000 codifies the cutinase transcription factor 1α that is involved in the induction of the expression of cutinases genes by fatty acids in ascomycetes, and the ORF NCU06971 codifies the protein XlnR a transcription factor responsible for the transcription activation of genes involved in the xylan degradation. The results described... (Complete abstract click electronic access below)
Keywords: Biotecnologia; Biologia molecular; Transcrição gênica; Molecular biology