Teses - Farmacologia e Biotecnologia - IBB

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Efeito da proteína oviutal HSPA5 na produção in vitro de embriões bovinos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-11) Santos, Priscila Helena dos [UNESP]; Castilho, Anthony Cesar de Souza; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A proteína HSPA5 (do inglês, heat shock 70 kDa protein 5), também conhecida como GRP78 (do inglês, 78 kDa glucose-regulated protein) e BiP (do inglês, immunoglobulin-binding protein), é uma chaperona do retículo endoplasmático que desenvolve um papel fundamental na manutenção da homeostase celular. Relativamente recente, essa proteína foi descrita como um dos componentes do fluido ovidutal com capacidade de se ligar aos espermatozoides e aumentar a concentração de cálcio intracelular. Considerando que o ambiente ovidutal fornece substratos e fatores importantes para a fusão dos gametas e desenvolvimento inicial embrionário in vivo e que a proteína HSPA5está em alta concentração no fluido ovidutal, nós acreditamos que essa proteína pode exercer efeitos benéficos na produção de embriões in vitro. Hipotetizando que a HSPA5 pode interagir com o complexo cumulus-oócito (COC) durante a maturação in vivo (MIV) e também com o embrião em desenvolvimento durante o cultivo in vitro (CIV), a temática primordial desta tese foi testar a adição da HSPA5 recombinante humana na produção in vitro de embriões (PIVE). Em um primeiro momento, nós analisamos o efeito da HSPA5 nas últimas 4 horas da MIV sobre os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) dos oócitos e subsequentes embriões, os níveis de glutationa (GSH) nos COCs e meio de cultivo, a solubilidade da zona pelúcida e penetração espermática, sobre a taxa de embriões produzidos e o perfil de transcritos destes embriões. Na segunda abordagem nós testamos a adição da rHSPA5 nos oito dias de CIV e comparamos com o tratamento na MIV e a associação dos dois tratamentos. Foi avaliado a taxa de embriões produzidos e a transcrição gênica destes embriões. Em suma, os resultados indicaram que a rHSPA5 é capaz de interagir com o COC durante a MIV e com os embriões em desenvolvimento no CIV. A proteína foi capaz de aumentar taxa de embriões produzidos quando adicionada nas últimas 4 horas de MIV, manter os níveis de ROS e GSH nos COCs, mas não aumentou o tempo de solubilidade da zonna-pellucida (ZP) ou alterou a porcentagem de monospermia, mas a rHSPA5 na MIV foi capaz de modular positivamente a expressão gênica dos embriões produzidos. Já a inclusão da proteína no CIV, apesar de haver uma pequena modulação na expressão gênica, não foi capaz de aumentar a taxa de embriões produzidos. Com os presentes achados, concluímos que, a HSPA5 pode interagir com o COC e ser capaz de exercer funções ainda não determinadas, assim como o uso da rHSPA5 nas últimas 4 horas da MIV pode otimizar a PIVE e potencializar a qualidade embrionária.
Influência da exposição ao benzo(a)pireno no período juvenil até a peripuberdade: repercussões imediatas em ratos machos e efeitos multigeracionais e transgeracionais na prole sob parâmetros reprodutivos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-01) Jorge, Bárbara Campos [UNESP]; Arena, Arielle Cristina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Introduction: Benzo(a)pyrene (BaP) is a substance formed by the incomplete combustion of organic compounds and is ubiquitously spread in the environment. Moreover, it is a substance with endocrine-disrupting potential that can alter the generation that was directly exposed to the injury (F0) as well as the next generation (F1). Human exposure to BaP is given through several pathways, and using an experimental rodent model, we evaluated low dose BaP with emphasis on the reproductive system during the juvenile and peripubertal period (development critical window of hormone dependent). Thus, this study evaluated the consequences of paternal (F0 generation) exposure to BaP, from juvenile to peripuberty, in F0, F1 and F2 generations on reproductive parameters in rats. Furthermore, we aimed to contribute new findings to the paradigm of the paternal origins of health and disease (POHaD), an under-explored field highly relevant to reproductive toxicology. Materials and methods: Male Wistar rats (Postnatal Day (PND) 23) were distributed into two groups (n=16 animals/group): control group (corn oil + DMSO - vehicle) and BaP-exposed group (vehicle + 0.1 μg/kg/day BaP). Treatment occurred for 31 consecutive days, orally (gavage). On PND 54, half of the animals were killed for immediate evaluation in toxicological and reproductive parameters (n=8/group). On PND 120, the rats were mated (F0 generation - n=8/group) with untreated females to obtain the F1 generation (males and females). In the adult life of the F1 generation, males were mated with untreated females to obtain the paternal lineage F2 generation (PF2) and females of the F1 generation were mated with untreated males to obtain the maternal lineage F2 generation (MF2); in both lineages, PF2 and MF2, we evaluated key points for the evaluation of reproductive toxicology. At adulthood (PND 120) of males of the F0, F1 and F2 generations, we evaluated hormone levels, testicular steroidogenic enzymes, oxidative stress in the testis and markers of proliferation and apoptosis in the seminiferous tubules. Results: On PND 54, the animals showed a decrease in the relative weight of the kidney and liver and a decrease in leukocytes. In addition, there was a reduction in diameter, height of the seminiferous tubules and serum testosterone (sT), altering spermatogenic dynamics, as well as Leydig cell (LC) atrophy and an increase in FSH levels. All steroidogenic enzymes and transporter proteins evaluated were reduced, except for StAR protein in the testis. Expression of gstp1 and ckit were decreased. The levels of antioxidants (GSH, SOD and selk) were increased, while MDA was decreased in the testis of the BaP group. Regarding to the PF2 generation, males in the BaP group showed a decrease in anogenital distance on PND 1, as well as a reduction in fertility potential, type A sperm and CL number. The females of the BaP group of the PF2 generation showed precocious puberty, decreased lordosis score in fertility, and morphological alterations of the ovary/uterus. As for the MF2 generation, the pups showed an increase in body weight on PND 1 in both sexes. The MF2 males showed a delay in puberty, altered weight of the pups in the fertility test, reduced FSH levels and increased intratesticular testosterone (iT), in addition to decreased type A sperm, histological disturbances in the epididymis, reduced 5 α-reductase, increased testicular proliferation, and increased testicular antioxidant enzymes in the BaP group. MF2 generation females showed increased uterine thickness, decreased sexual activity and decreased progesterone. Regarding the evaluations performed in the adult life of males (PND 120) of the three generations (F0, F1 and PF2) we obtained the following results: MDA was increased in all generations of the BaP group. FSH and LH decreased in F0 and sTs and iT decreased in F0 and F2 generations. Steroidogenic enzymes and transporter proteins were not altered at F0. In the BaP group of F1, only the 17β-HSD enzyme was decreased. In the PF2 generation, all enzymes and proteins evaluated were 6 decreased except cyp17a1. In F1 and PF2, cell proliferation markers (PCNA and ckit) were decreased in the seminiferous tubules. Bax expression was increased in F1 and F2, while Bcl-2 was increased only in the F0 generation of the BaP group. Conclusions: BaP caused several reproductive changes in the F0, F1, PF2 and MF2 generation that were detrimental at different levels to the fertility of these animals. Furthermore, we reinforce the need for expansion in studies on the POHaD paradigm and paternal relevance to offspring health.
Avaliação da dinâmica hepática por Biosusceptometria AC e biodistribuição de nanopartículas magnéticas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-08) Soares, Guilherme Augusto [UNESP]; Miranda, Jose Ricardo de Arruda [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A presente tese de doutorado inclui resultados de trabalhos que foram realizados em estudos envolvendo a técnica de Biosusceptometria AC (BAC) e nanopartículas magnéticas (NPMs). A partir de uma sequência de trabalhos utilizando NPMs, os resultados aqui apresentados são passos importantes para compressão de parâmetros fisiológicos do sistema biológico como de parâmetros farmacocinéticos para as NPMs. O enfoque de ambos os trabalhos é uma avaliação direcionada ao fígado, considerado o principal órgão responsável pela captura de NPMs da corrente sanguínea. O primeiro trabalho a ser exibido nesse documento é uma avaliação de tempo longo, na qual foi investigado por 60 dias o perfil de acumulo e distribuição de NPMs administradas intravenosamente. Nesse estudo, os resultados indicaram uma maior captação pelo fígado e pelo baço devido às suas características de retenção e captação. Em 60 dias, observou-se ausência de NPMs no baço e uma deterioração significativa no fígado. Os dados indicaram um perfil de decaimento da concentração ao longo dos 60 dias, o que sugere que, além da eliminação pelas fezes, existe um mecanismo endógeno de metabolização ou possível aglomeração de NPMs, o que resulta em perda da intensidade do sinal BAC. Uma vez que as NPMs apresentam a possibilidade de serem usadas como sondas multifuncionais para diagnóstico e tratamento nos últimos anos de doenças hepáticas, no segundo trabalho objetivou-se avaliar como a condição de cirrose influencia e afeta a função hepática, utilizando NPMs. Através de uma abordagem de aquisição de imagens em tempo real pelo sistema BAC, monitorou-se o perfil de distribuição das NPMs após a administração intravenosa. Para avaliar o perfil da biodistribuição, regiões de interesse (ROIs) foram selecionadas em partes referentes ao fígado e ao coração nas imagens de acordo com as referências anatômicas. Os sinais obtidos permitiram empregar um protocolo da quantificação de parâmetros farmacocinéticos, que indicaram que captação hepática é realmente comprometida durante a cirrose, o que influencia principalmente a troca de sangue entre o parênquima hepático e circulação. Uma vez que as células de Kupffer se mantiveram constantes durante a etapa cirrótica, o processo de capilarização dos sinusoide hepáticos foi considerado como a principal razão para a alteração da função hepática.
Efeitos do sildenafil na hipertensão arterial induzida pela intoxicação com chumbo em ratos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-23) Caetano, Edileia de Souza Paula; Dias Junior, Carlos Alan Candido [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O chumbo é um poluente ambiental capaz de causar distúrbios cardiovasculares como a hipertensão arterial. Esse fenômeno pode ser explicado pelo aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) ou aumento da reatividade vascular a agentes constritores. O sildenafil é um inibidor da fosfodiesterase atualmente utilizado para o tratamento da disfunção erétil. Além disso, inovou os tratamentos de crises hipertensivas, hipertensão pulmonar e isquemia miocárdica por inibição da fosfodiesterase 5 (PDE5). Essa inibição promove o acúmulo de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc). A produção de GMPc resulta da ativação da guanilato ciclase solúvel pelo NO produzido nas células endoteliais. Esses mecanismos induzem o relaxamento do músculo liso como resultado da diminuição dos níveis intracelulares de cálcio. Para avaliarmos os efeitos do sildenafil na hipertensão induzida por chumbo em ratos, ratos Wistar aproximadamente 90 dias de vida cujo peso corporal variava entre 250 e 400g, foram distribuídos em três grupos experimentais: chumbo+Sildenafil (Pb+Sildenafil), chumbo (Pb) e controle (Sham). Os animais dos grupos Pb+Sildenafil e Pb receberam por via intraperitoneal (i.p) acetato de chumbo 8 µg/100g de peso corporal/dia no primeiro dia do protocolo. A intoxicação foi mantida com acetato de chumbo 0,1 µg/100g de peso corporal/dia por sete dias subsequentes. O grupo Pb+Sildenafil e Sildenafil recebeu 15 mg/kg/dia por gavagem. O grupo Sham recebeu ainda acetato de sódio i.p. nas mesmas concentrações de acetato de chumbo em relação aos outros grupos e água por gavagem 0,5 ml/kg/dia. A pressão arterial sistólica (PAS) foi mensurada por pletismografia de cauda diariamente até o oitavo dia, quando os animais foram mortos por exsanguinação. O sangue foi coletado para determinação das concentrações de chumbo no sangue total realizado por espectrometria de absorção atômica, O plasma dos ratos foi armazenado para dosagens dos níveis plasmáticos de nitrito+nitrato, capacidade antioxidante (FRAP), peroxidação lipídica (TBARS) e atividade da superóxido dismutase (SOD). Além disso, o plasma dos ratos foi incubado com células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVECs ) para avaliar a produção de NO endotelial, de nitrito+nitrato e a formação de ERO intracelular. O Sildenafil preveniu a hipertensão induzida por baixas concentrações de chumbo e reestabeleceu vasodilatação endotélio-NO-dependente, reduziu a formação de ERO, aumentou a atividade da superóxido dismutase (SOD) e melhorou os níveis dos metabólitos de NO. No entanto, não foram encontradas alterações na detecção direta de NO intra-HUVECs, mostrando que os efeitos fornecidos pelo sildenafil na hipertensão induzida por chumbo em ratos está relacionado as propriedades antioxidantes desta droga que protegem contra a inativação do NO mediada por ERO, prevenindo assim a hipertensão e a disfunção endotelial causadas pela intoxicação por chumbo.
Parâmetros gastrintestinais e metabólicos na obesidade: efeitos transgeracionais e de plicatura gástrica em roedores
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-30) Machado, Mariana Pirani Rocha [UNESP]; Américo, Madileine Francely; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A obesidade paterna pode acarretar alterações na função gastrointestinal (GI) e tal efeito pode se manifestar também na prole masculina por questões epigenéticas. Além disso, tratamentos cirúrgicos da obesidade como a Plicatura Gástrica (PG) podem causar alterações no trânsito GI e em níveis hormonais, apesar de reduzirem o peso e quantidade de gordura corporal. Diante do exposto, empregar dois modelos de obesidade experimentais in vivo e a técnica biomagnética BAC, pode contribuir para a caracterização da motilidade gastrintestinal e de um tratamento cirúrgico reversível em obesos. Assim, os objetivos desse trabalho foram: 1) Avaliar comparativamente a função gastrointestinal e a morfologia em modelo experimental de obesidade paterna induzido por glutamato monossódico e duas gerações subsequentes de descendentes machos; 2) Verificar as funções metabólicas e gastrointestinais em modelo experimental de obesidade induzida por dieta hiperlipídica (High-Fat Diet - HFD) submetido à cirurgia de plicatura gástrica. Ratos obesos induzidos por MSG (F1) apresentaram diminuição na frequência e amplitude das contrações gástricas, enquanto ratos obesos da geração F2 mostraram MGET acelerado e MCAT e MSITT lentificados. Os níveis de glicose e leptina estavam aumentados em F1 e F2. Os níveis de insulina diminuíram nas gerações F1, F2 e F3. A morfometria duodenal mostrou-se alterada nas três gerações sugerindo que a obesidade pode ter transmissão transgeracional paterna. Em suma, foram observados distúrbios na função gastrointestinal de três gerações, ressaltando a importância de se considerar um ciclo paterno de obesidade para entender a extensão dos distúrbios da doença sobre a fisiologia gastrointestinal. Na segunda parte deste estudo, observou-se que a plicatura gástrica (PG) não foi capaz de reverter o esvaziamento gástrico lentificado presente em obesos e até piorou a variabilidade em torno da frequência média, sugerindo uma disritmia no período analisado após o procedimento. A PG possivelmente desencadeou remodelamento nas camadas mucosas e musculares das mucosas, tornando se mais espessas e apresentando infiltrados inflamatório. Todavia, houve uma diminuição significativa dos níveis de leptina e do peso corporal, principalmente nos grupos obesos. Este estudo analisou as consequências para o trato GI do desenvolvimento de novas estratégias cirúrgicas para o tratamento, bem como da contribuição transgeracional na obesidade. Desta forma, os modelos de obesidade aqui adotados foram eficazes e ressaltaram a importante contribuição da função gastrointestinal sobre a manutenção do peso corporal e na saúde da prole. Nesse contexto, alterações na motilidade nem sempre são totalmente compreendidas ou consideradas relevantes durante a condução de estudos em obesos
Biosusceptometria de corrente alternada aplicada ao trato gastrintestinal: gastrectomia vertical, imagens e problema inverso
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-18) Pinto, Leonardo Antonio; Miranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Próspero, André Gonçalves; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A proposta deste trabalho consiste na aplicação da técnica de Biosusceptometria de Corrente Alternada (BAC) associada ao trato gastrintestinal, com o intuito de estabelecer uma nova metodologia que possibilite estudos do efeito de doenças e alterações fisiológicas na motilidade gastrintestinal. Foram realizados experimentos com ratos para a avaliação dos efeitos da cirurgia de gastrectomia vertical na motilidade gastrintestinal, e, de forma inédita, analisar o trânsito gastrintestinal regional através de imagens obtidas com o sistema BAC. Além disso, este trabalho apresenta a implementação de modelos matemáticos e computacionais para a resolução do problema inverso dos sistemas BAC mono e multi canal para reconstruções quantitativas de distribuições 2D de nanopartículas magnéticas (MNPs). No estudo da gastrectomia vertical, avaliamos os efeitos do procedimento cirúrgico na motilidade gastrintestinal (esvaziamento gástrico, trânsito orocecal e contratilidade gástrica), parâmetros nutricionais, morfometria e histopatologia do estômago, perfil lipídico e percentual de gordura. O trabalho acerca do trânsito gastrintestinal regional através de imagens é uma aplicação inédita da técnica BAC para a avaliação de parâmetros gastrintestinais em ratos através do escaneamento de amostras, fato que permite a análise da distribuição intrasegmentar de traçadores magnéticos. A metodologia proposta foi validada com a técnica de vermelho de fenol, considerada padrão ouro em ratos. Por fim, a resolução do problema inverso para sistemas BAC contendo uma e múltiplas bobinas detectoras é aplicada para reconstruir imagens quantitativas de fantomas contendo MNPs. As imagens quantitativas apresentam os pixels na unidade de massa de nanopartículas, possibilitando o uso da técnica BAC em diversas aplicações biomédicas envolvendo o uso de MNPs e também para o estudo do trato gastrintestinal. Os resultados desse trabalho demonstram a aplicação da técnica BAC para o estudo do trato gastrintestinal através de distintas metodologias, o que proporcionará o desenvolvimento de trabalhos inovadores nas áreas de motilidade gastrintestinal, engenharia biomédica e nanopartículas magnéticas.
Efeitos da artrite induzida por adjuvante (AIA) sobre as respostas de veias à noradrenalina e angiotensina II
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-30) Montenote, Michelly Cristina; Chies, Agnaldo Bruno; Spadella, Maria Angélica; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Na artrite reumatoide (AR) mediadores inflamatórios derivados das articulações inflamadas podem causar manifestações extra-articulares. Manifestações da AR que acometem o sistema cardiovascular podem ter impacto na expectativa de vida dos pacientes. Os efeitos vasculares induzidos pela AR são mais conhecidos em artérias, embora não se descarte que alterações no leito venoso poderiam resultar em alterações na complacência venosa e, por consequência, na dinâmica circulatória. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da artrite induzida por adjuvante (AIA) em diferentes respostas das veias cava, femoral, mesentérica e porta à noradrenalina (NOR) e angiotensina II (Ang II), com foco no funcionamento dos mecanismos endoteliais relacionados ao óxido nítrico (NO) e aos prostanoides. Portanto, fez-se a indução da AIA em ratos Wistar machos através da administração de uma emulsão contendo Mycobacterium tuberculosis (3,8 mg/Ml), por via intradérmica, na planta da pata traseira direita. Esses animais foram mortos 4, 15 e 40 dias após a indução da AIA e suas veias cava, femoral, mesentérica e porta foram desafiadas em banho de órgãos com NOR e Ang II, na ausência ou na presença L-NAME, indometacina e/ou 1400W. Os resultados mostram que a AIA reduz as respostas nessas veias no 4° e 15° dias após a indução da AIA, mas não na fase tardia. Em relação à NOR, essa redução ocorre apenas na veia femoral, enquanto para Ang II, essa redução foi observada nas veias cava, mesentérica e porta. Essas reduções de resposta tanto à NOR quanto à Ang II foram suprimidas na presença de L-NAME, mas não na presença da indometacina, o que sugere o envolvimento do NO nesse fenômeno. O 1400W suprimiu a redução das respostas da veia femoral à NOR, assim como das veias cava e mesentéricas à Ang II, causadas pela AIA no 15° dia pós-indução. Isso sugere que, nessas preparações, o aumento da produção local de NO causado pela AIA ocorre através da estimulação da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS). No 4° dia pós-indução, as respostas das veias cava, mesentérica e porta permanecem reduzidas nos animais AIA, mesmo em preparações tratadas simultaneamente com L-NAME e indometacina. Este dado sugere a participação de um mecanismo ainda 8 desconhecido, não relacionado ao NO ou prostanoides, nessa redução de resposta causada pela AIA na fase mais precoce do modelo.
Células tronco embrionárias e induzidas ao estado de pluripotência em bovinos: características moleculares e aplicação em quimeras embrionárias
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-05) Botigelli, Ramon César; Nogueira, Marcelo Fábio Gouveia [UNESP]; Bressan, Fabiana Bressan; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Células tronco pluripotentes são uma ferramenta fundamental para os estudos da embriologia, para o desenvolvimento de estudos clínicos in vitro, para a medicina regenerativa e mais recentemente, para a produção de gametas in vitro. Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). No entanto, condições ambientais e de cultura in vitro, como a utilização de diferentes suplementos para a manutenção da pluripotência podem diminuir e modular a eficiência da reprogramação à pluripotência. Dessa forma, a presente tese teve como objetivo estudar os efeitos do oxigênio e de diferentes suplementos para a manutenção da pluripotência no cultivo e reprogramação de células iPSCs de bovinos (biPSCs). No primeiro estudo, fibroblastos fetais de bovinos foram reprogramados em diferentes tensões de oxigênio (baixo ou alto oxigênio) e diferentes suplementos para a manutenção de pluripotência, bFGF ou bFGF+LIF+CHIR+PD (bFL2i). Em nossas condições experimentais, baixo oxigênio não aumentou a eficiência de reprogramação quando comparada a reprogramação em alto oxigênio. Por outro lado, a suplementação bFL2i aumentou a eficiência de reprogramação das biPSCs. As biPSCs derivadas com bFL2i em baixo oxigênio indicaram ausência de habilidade de auto renovação. As linhagens caracterizadas foram positivas para fosfatase alcalina, positivas para a expressão de genes marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4 e STELLA), no entanto, negativas para NANOG. Ainda, baixo oxigênio aumentou a expressão de GLUT1 e GLUT3. As biPSCs também foram positivas na imunofluorescência para OCT4 e SOX2, mas negativas para NANOG. As biPSCs foram competentes em formar corpos embrióides e estes expressão marcadores de mesoderme e ectoderme, ainda, uma linhagem apresentou expressão de endoderme. No segundo estudo, fibroblastos fetais de bovinos foram reprogramados com diferentes suplementos para a manutenção da pluripotência (fatorial 2x2; bFGF, bFGF2i, LIF, LIF2i), ainda, linhagens de células tronco embrionárias foram isoladas para serem comparadas com as biPSCs geradas. A reprogramação de biPSCs foi mais eficiente com bFGF. As linhagens derivadas com LIF2i indicaram ausência de habilidade de auto renovação. As linhagens biPSCs e bESCs foram positivas para fosfatase alcalina. As biPSCs e bESCs foram positivas para a expressão de genes marcadores de pluripotência (SOX2, OCT4, STELLA, LIFr e OTX2) e somente as biPSCs expressaram NANOG e ESRRb. Ainda, biPSCs e bESCs foram positivas para SOX2, OCT4 e H3K27me3, negativas para NANOG na imunofluorescência. As biPSCs e bESCs foram competentes em formar corpos embrióides, estes expressaram marcadores de mesoderme, ectoderme e endoderme. Ainda, nossos resultados indicaram que em nossas condições, as biPSCs foram mais competentes comparadas as bESCs para a contribuição de blastocistos quiméricos quimeras. Por fim, nossos resultados demonstram que a reprogramação de biPSCs é possível em baixo e alto oxigênio. No entanto, a suplementação LIF2i e bFL2i (baixo oxigênio) não promoveram a auto renovação das biPSCs. Também, as biPSCs e bESCs geradas e isoladas apresentaram características de pluripotência, onde, biPSCs foram mais competentes em contribuir em quimeras embrionárias
O papel do estradiol no oviduto bovino: evidências in vivo e in vitro
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-10-15) Fontes, Patricia Kubo; Castilho, Anthony César de Souza; Binelli, Mário; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O oviduto desempenha diversas funções até a formação do embrião, como maturação e transporte final dos gametas, processo de fertilização, transporte do embrião e desenvolvimento inicial do embrião. No entanto, nenhuma dessas etapas precisa ocorrer obrigatoriamente no oviduto. A capacidade de desenvolver embriões até o estágio de blastocisto sem qualquer contato com o trato reprodutivo materno gerou a hipótese de que o oviduto seria secundário e não essencial no estágio inicial da vida. Hoje, no entanto, é amplamente conhecido que a interação embrião-oviduto, ou interação com produtos de células ovidutais, pode impactar o embrião de diferentes maneiras, especialmente em relação às características epigenéticas, metabolismo e vários marcadores de qualidade. Para reconectar o embrião em desenvolvimento às células ovidutais (OC), muitas abordagens artificiais foram delineadas. Nesta tese, investigamos as CO diante de duas dessas abordagens: os protocolos de superestimulação ovariana (SOV) e a cocultura in vitro de embrião-CO. No primeiro estudo, as vacas foram submetidas à: i) protocolo SOV apenas com hormônio folículo-estimulante (FSH), ii) protocolo SOV usando FSH com gonadotrofina coriônica equina (eCG), ou iii) ovulação única por sincronização hormonal. O uso de protocolos SOV permite o desenvolvimento de múltiplos embriões dentro do oviduto, possibilitando a interação dos embriões com as CO. Este primeiro estudo demonstrou que as CO de vacas submetidas à SOV com FSH + eCG apresentam níveis mais elevados de estradiol, que também modulou a expressão gênica de genes relacionados ao processo de fertilização. Em seguida, esse perfil hormonal foi aplicado em um sistema de cultivo in vitro de OC. As CO podem ser cultivadas para aplicação em sistema de cocultura com embriões, o que permite que o embrião produzido in vitro interaja com as CO. A cultura de OC ainda não possui protocolo padrão ouro. Portanto, para analisar o efeito dos diferentes perfis hormonais obtidos como resultado do primeiro estudo, foi necessário incluir outra variação no segundo estudo: diferentes perfis hormonais x CO coletadas em diferentes fases do ciclo estral. Ao analisar os dados obtidos na análise de RNAseq, após o cultivo in vitro, as OC coletadas durante a fase folicular apresentam um perfil de transcriptoma muito diferente do perfil das células coletadas na fase lútea, caso nenhum tratamento hormonal for aplicado. Porém, quando altos níveis de estradiol são aplicados na cultura in vitro dessas células, o perfil do transcriptoma das CO torna-se muito semelhante, independentemente do ciclo estral em que as CO foram coletadas. Em conclusão, essas duas abordagens artificiais para possibilitar a interação dos embriões com o oviduto modulam as CO em função dos perfis hormonais. Portanto, o perfil hormonal é um fator importante a ser considerado nas estratégias para estabelecer a interação de embriões e células ovidutais.
Efeitos dos betas-bloqueadores na sepse em camundongos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-05-15) Silva, Katiussia Pinho da; Pupo, André Sampaio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Introdução: Sepse é uma das mais antigas síndromes reconhecidas na história da medicina. Atualmente, é descrita como uma resposta inflamatória sistêmica desregulada do hospedeiro à infecção que ocasiona diversos comprometimentos orgânicos. Neste sentindo, a disfunção cardíaca é uma das características comum entre os pacientes sépticos e contribui para a taxa de mortalidade associada à sepse. Dados recentes mostraram que a hiporesponsividade cardíaca na sepse está relacionada à internalização dos β-adrenoceptores (β-ARs) (Dal Secco, D., et al., 2017). Interessantemente, tem sido apontado o benefício hemodinâmico com a utilização do esmolol (β-bloqueador) na sepse. É sabido que os β-bloqueadores apresentam um perfil farmacológico distinto entre eles, especialmente no que diz respeito à atividade simpatomimética intrínseca. Ou seja, alguns β-bloqueadores agem como agonistas parciais nos β-ARs e portanto, promovem certo grau de inotropismo positivo. Considerando a associação da disfunção cardíaca na sepse com a internalização dos β-ARs, esta tese tem como racional farmacológico que os β-bloqueadores com atividade simpatomimética intrínseca (eficácias) variando de “zero” (propranolol, bisoprolol) a “moderado” (carvedilol
Efeito do IGF-1 e da PAPP-A sobre aspectos do metabolismo lipídico e estresse oxidativo de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-06-15) Franchi, Fernanda Fagali [UNESP]; Castilho, Anthony César de Souza [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A proteína plasmática A associada à gravidez (PAPP-A) é uma metaloprotease, que tem como função aumentar a biodisponibilidade do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 1 (IGF-1), um peptídeo com diversas funções em prol do bom desenvolvimento oocitário e embrionário. Assim, a temática principal dessa tese foi utilizar a PAPP-A como um potencializador dos efeitos atribuídos ao IGF-1 durante a PIVE de bovinos. No primeiro artigo, investigamos o efeito da adição de PAPP-A durante a MIV suplementada com soro fetal bovino (SFB). Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram maturados in vitro por 24 horas na presença ou ausência de SFB e, posteriormente, foram fertilizados e cultivados in vitro. Analisamos o conteúdo lipídico dos oócitos e blastocistos usando o corante Sudan-Black B, a taxa de blastocistos produzidos e a expressão gênica de 96 genes por RTqPCR. Não houve diferença no conteúdo lipídico dos oócitos e blastocistos avaliados, nem na taxa de blastocistos produzidos. No entanto, a presença de PAPP-A durante a MIV diminuiu a expressão de 22 genes relacionados à síntese de lipídeos, apoptose e estresse celular e qualidade embrionária nos blastocistos produzidos. No segundo artigo, os CCOs foram maturados (tratamento na MIV) ou os embriões cultivados (tratamento no CIV) por 24h com adição de IGF-1, IGF-1/PAPP-A, ou na ausência de ambos, em um ambiente estresse-induzido pela presença de menadiona. Avaliamos nos oócitos a progressão da meiose, concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o potencial de membrana mitocondrial por técnicas de coloração utilizando sondas específicas. Também analisamos as concentrações de glutationa total (GSH) nos CCOs, blastocistos e meios de MIV e CIV, além da taxa de blastocistos produzidos e a expressão gênica dos embriões por RTqPCR. A combinação IGF-1/PAPP-A resultou nas menores concentrações de EROs em oócitos e blastocistos e também modulou positivamente nos embriões genes envolvidos na defesa antioxidativa, metabolismo lipídico e qualidade embrionária, além de aumentar a taxa de blastocistos produzidos quando utilizadas na CIV. Assim, concluímos que o uso da PAPP-A, durante a PIVE de bovinos, foi efetivo como uma estratégia para maximizar as ações mediadas por IGF-1. Especificamente, reiteramos que a combinação IGF-1/PAPP-A teve efeitos mais marcantes, potencializando a proteção antioxidativa e a qualidade embrionária, além de aumentar quantitativamente o número de blastocistos produzidos em um ambiente estresse-induzido.
Uso de TUDCA na modulação do estresse do retículo endoplasmático em etapas da produção in vitro de embriões bovinos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-20) Pioltine, Elisa Mariano; Nogueira, Marcelo Fábio Gouveia [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Embora estágios iniciais de embriões de mamíferos tenham aparentemente uma grande plasticidade, eles, assim como o oócito em maturação, são bastante sensíveis a estresses exógenos. Responder a esses estresses é uma parte vital da fisiologia celular. Cada vez mais é aparente que um dos principais mecanismos, para iniciar a resposta celular a uma variedade de estressores exógenos, reside no retículo endoplasmático (RE). O RE é uma importante organela responsável pela síntese, processamento e transporte de proteínas e lipídeos. No entanto e in vitro, a perturbação do microambiente do RE pode causar alterações na estrutura das proteínas levando ao acúmulo de proteínas com o incorreto dobramento, uma condição denominada estresse do RE. Dependendo da intensidade do estresse, o RE pode desencadear a apoptose pela Unfolded Protein Response. Em várias espécies, estudos observaram uma melhoria da competência do oócito e no desenvolvimento do embrião quando foram adicionados inibidores do estresse do RE no meio de maturação e/ou meio de cultivo in vitro (CIV). Dentre os inibidores do estresse do RE, o ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) se mostrou benéfico na produção in vitro de embriões. Entretanto, pouco é conhecido sobre o seu efeito na maturação oocitária e no desenvolvimento do embrião bovino in vitro. Portanto, os objetivos gerais desta Tese foram: Capítulo 1 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante a maturação in vitro (MIV) sobre a competência do oócito e do embrião [maturação nuclear, atividade mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), formação de pro núcleo, formação de blastocisto e abundância de transcritos em oócitos e embriões] e Capítulo 2 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante o CIV sobre a competência embrionária e a criotolerância do embrião (cinética de eclosão e abundância de transcritos de embriões antes e após a vitrificação). A adição de TUDCA na MIV não melhorou a competência oocitária. Entretanto, a adição de 200 µM de TUDCA pareceu aliviar o estresse do RE reduzindo a produção de ERO no oócito e aumentando a abundância de transcritos relacionados positivamente com a defesa antioxidante do oócito e do embrião. Contrariamente, a adição de 1.000 µM de TUDCA na MIV pareceu ser tóxica para o oócito e diminuiu a taxa de maturação nuclear bem como a atividade mitocondrial. Além disso, houve um aumento da abundância de transcritos pró-apoptóticos no oócito. Quando o TUDCA foi suplementado no CIV não houve melhora da competência embrionária. De forma semelhante que na MIV, a adição de 1.000 µM de TUDCA no CIV pareceu ser tóxica para o embrião e diminuiu a taxas de blastocisto eclodido. De modo complementar, houve um aumento da abundância de transcritos relatados negativamente com o estresse do RE, o estresse oxidativo, o metabolismo lipídico e a sobrevivência celular. Entretanto, a adição de 200 µM de TUDCA no CIV pareceu aliviar o estresse do RE em embriões submetidos à vitrificação. Com isso, houve o aumento da taxa de embrião eclodido após o aquecimento. Além disso, nos blastocistos eclodidos pós-aquecimento foi observada uma redução da abundância de transcritos relacionados negativamente com o estresse do RE e um aumento daqueles relacionados positivamente com o mecanismo antioxidante e o desenvolvimento embrionário.
Avaliação do sistema redox pela via de ativação do Nrf2 e potencial efeito antioxidante do resveratrol em modelo in vitro de pré-eclâmpsia
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-17) Dias, Mayara Caldeira [UNESP]; Sandrim, Valéria Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A pré-eclâmpsia é uma das principais causas de mortalidade e morbidade entre as gestantes no Brasil e em vários países. A fisiopatologia desta doença é complexa e envolve vários processos. Um desses relaciona-se a um status oxidativo, onde há prevalência de produção de radicais livres e/ou redução da atividade antioxidante. Recentemente, vem sendo explorado como terapia em várias doenças o antioxidante resveratrol, presente em grandes quantidades principalmente nas uvas vermelhas. O resveratrol, além de sequestrar espécies reativas de oxigênio e possuir outros mecanismos de ação, atua ativando o fator de transcrição Nrf2 (nuclear factor, erythroid 2-like 2), responsável pela transcrição de diversos genes que promovem a proteção celular através da codificação de enzimas antioxidantes, como a hemeoxigenase (HO-1). Logo, o objetivo desse estudo foi verificar os efeitos do resveratrol sob a via de ativação do Nrf2 e seus genes alvos em modelo in vitro de pré-eclâmpsia. Esse modelo consiste na incubação de plasma/soro de pacientes pré-eclâmpticas em células endoteliais a fim de se mimetizar a disfunção endotelial característica dessa síndrome. Além disso, foi feito um estudo clínico piloto em que gestantes pré-eclâmpticas beberam suco de uva de forma aguda e tiveram o soro coletado após 1 hora da ingestão para incubação nas células endoteliais. Concluímos que há um potencial de uso do resveratrol na prevenção e tratamento da pré-eclâmpsia. Considerando ainda o uso do suco de uva ao invés do resveratrol isolado, por ser rico em diversos antioxidantes, esses podem ter uma ação conjunta potenciando ainda mais os efeitos benéficos na pré-eclâmpsia. Os estudos ainda são escassos e há muito que se investigar e aprofundar, logo futuros estudos devem ser realizados, principalmente estudos clínicos, para que haja embasamento científico suficiente para se sugerir como prática clínica o uso do resveratrol/suco de uva como auxílio na prevenção e manejo da pré-eclâmpsia.
Estudo experimental dos efeitos da exposição repetida ao herbicida atrazina sobre a atividade neurocomportamental, biomarcadores do estresse oxidativo e sistema dopaminérgico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-20) Anselmo, Fábio; Godinho, Antonio Francisco [UNESP]; Fernandes, Ana Angélica Henrique [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O herbicida atrazina (ATR) é um praguicida usado intensivamente na agricultura, que persiste no meio ambiente e causa toxicidade em espécies não-alvo, inclusive seres humanos. Considerando o potencial da ATR para produzir efeitos no sistema nervoso central (SNC) e a falta de informações na literatura corrente sobre esse tipo de toxicidade, o objetivo deste projeto de pesquisa foi avaliar os efeitos da exposição subcrônica ao herbicida ATR sobre parâmetros neurocomportamentais específicos e estabelecer sua correlação com o estresse oxidativo (EO) em tecido cerebral de ratos e com o sistema dopaminérgico em regiões específicas do cérebro, nominalmente córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HIP) e corpo estriado. Ratos Wistar machos receberam solução salina (0,3 ml; controle - Ct), atrazina (ATR; 100 mg/kg), atrazina mais vitamin E (ATR; 100 mg/Kg + VE; 200 mg/kg), apenas vitamina E (VE; 200 mg/kg), atrazina mais levodopa (ATR; 100 mg/Kg + LEV; 20 mg/kg) e apenas levodopa (LEV; 20 mg/kg), por gavage, durante 28 dias. O comportamento foi avaliado utilizando arena de campo aberto (ACA), labirinto em cruz elevado (LCE) e hole-board (HB). O teste de estresse oxidativo no tecido cerebral avaliou os níveis de malondialdeído (MDA), capacidade antioxidante hidrofílica (CAH) e atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). A dopamina (DA) foi quantificada por HPLC, em áreas cerebrais específicas (CPF, HIP e estriado). Exposição à ATR provocou ansiedade, diminuiu a coordenação motora e não alterou a atividade locomotora dos animais. A ATR não modificou os níveis de MDA, a CAH nem as atividades da SOD e CAT. No entanto, ATR+VE aumentou os níveis de MDA e a CAH enquanto a VE aumentou a atividade da SOD. Além disso, o tratamento com ATR não alterou os níveis de DA no estriado cerebral, mas aumentou sua concentração no CPF e no HIP. Como conclusão, observou-se que a exposição subcrônica ao herbicida ATR foi capaz de prejudicar parâmetros comportamentais específicos, principalmente aqueles relacionados a ansiedade e a coordenação motora. Esses prejuízos não estão relacionados com a indução de EO no tecido cerebral de ratos. Além disso, sugere-se atenção em situações de suplementação oral por VE, pois, quando combinada com substâncias do tipo praguicidas, pode exercer efeitos pró-oxidantes a nível de SNC. Adicionalmente a ATR foi capaz de causar perturbações nos sistemas dopaminérgicos cerebrais de ratos, principalmente nas regiões do CPF e HIP, não alterando os níveis de DA na região do estriado. Esses resultados reforçam a relação entre exposição à praguicidas e efeitos de neurotoxicidade.
Influência do omeprazol sobre processos de dissolução e desintegração gástrica de comprimidos pH-dependente
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-03-12) Pires, Deivid William; Miranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Corá, Luciana Aparecida; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A via oral de administração de fármacos é a mais utilizada devido a maior aceitação pelo paciente e sua fácil administração. Dentre as estratégias de sistema de liberação de fármacos estão os comprimidos revestidos com polímero pH-dependente, da qual o Eudragit E-100 é um polímero de revestimento protetor solúvel em pH <5, utilizado em formas farmacêuticas sólidas para liberação do fármaco no ambiente gástrico. Para que ocorra a liberação do fármaco é necessário que o comprimido revestido passe por processos que antecedem a absorção, tal como a dissolução do revestimento e desintegração. Sendo assim, se ocorrer mudanças no pH fisiológico o processo de dissolução do revestimento gastrossolúvel pode ser comprometido e consequentemente alterar a biodisponibilidade do fármaco. Diante deste cenário, é de grande importância realizar pesquisas que explorem a influencia do aumento do pH gástrico na biodisponibilidade de um fármaco, contido em comprimido com revestimento pH-dependente administrado concomitantemente. Nesta proposta consiste em empregar a Magnetofarmacocinética (MgPK) para avaliar a influencia da alteração do pH gástrico provocado pelo tratamento com omeprazol no processo de liberação de um fármaco modelo administrado pela via oral em comprimidos revestidos com Eudragit® E-100. Foi produzido um lote de comprimidos magnéticos revestidos com Eudragit® E -100 contendo 500 mg de ferrita e 100 mg de metronidazol. O lote foi avaliado através de testes farmacotécnicos e avaliados segundo o perfil de dissolução. Para os experimentos in vivo, cada voluntário foi submetido a duas fases de estudos (placebo e omeprazol), em dias distintos, para avaliar a biodisponibilidade do metronidazol. Os sistemas BAC multissensor e monossensor foram empregados para a avaliação em tempo real in vivo o processo de desintegração do comprimido e avaliar os parâmetros de início da desintegração ou tempo de retenção. As curvas do perfil de dissolução do Metronidazol em função do tempo demostram um deslocamento à direita no eixo do tempo, na medida em que o pH da solução aumenta. Ao analisar os parâmetros farmacotécnicos observa-se que em pH 4,5 e pH 6,0 ocorreu um atraso na dissolução do Metronidazol, mostrando que o aumento do pH interfere nos processos de liberação de comprimidos revestidos com Eudragit® E-100. Nos ensaios in vitro com o sistema BAC, na medida em que o pH do meio de dissolução aumenta, o tempo necessário para pág. 9 dissolver o revestimento aumenta, confirmando que a dissolução do polímero de revestimento utilizado neste estudo é dependente do pH. Nas medidas magnéticas realizadas nos voluntários, foi possível identificar dois perfis distintos: um grupo de participantes (n = 5) nos quais não foi possível caraterizar o processo de desintegração no tratamento com omeprazol, e outro grupo (n = 7) nos quais o processo foi quantificado. Para os participantes elencados no grupo I (n=5), os parâmetros farmacocinéticos obtidos após a administração do omeprazol foram nulos, ou seja, não foi possível obter o perfil de concentração plasmática do metronidazol. Por outro lado, nos participantes elencados no grupo 2 (n=7), foi possível obter valores de tlag, tmax e Início da Desintegração com diferenças significativas, indicando um possível atraso na liberação do fármaco. A abordagem magnetofarmacocinética (MgPK) empregada neste estudo, de forma inédita, contribui para avaliar criticamente o comportamento de uma forma farmacêutica sólida frente a um meio complexo como o TGI do homem.
Sistema folicular: um novo protocolo para a maturação oocitária in vitro. Efeitos na diferenciação do complexo cumulus-oócito e produção embrionária
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-21) Soares, Ana Caroline Silva; Buratini Junior, José [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos tem sido utilizada para aumentar a fertilidade e a velocidade do melhoramento genético em rebanhos de corte e leite, embora sua eficiência seja reconhecidamente baixa, principalmente em rebanhos leiteiros. A maturação oocitária in vitro (MIV) é considerada o principal gargalo tecnológico da PIV já que os protocolos vigentes não refletem a fisiologia e determinam descompasso entre a maturação nuclear e citoplasmática do oócito. Os oócitos submetidos à MIV são oriundos de folículos em diferentes fases de desenvolvimento e heterogêneos quanto ao grau de condensação da cromatina e estoques de transcritos importantes para o desenvolvimento embrionário inicial. Este projeto investigou um novo sistema para MIV, que inclui estratégia para obtenção de população homogênea de oócitos associado a um sistema de cultivo sequencial ajustado à fase de maturação dos oócitos recuperados, denominado fase pré-MIV do Sistema Folicular, que mimetiza as condições intrafoliculares antes da ovulação. Os experimentos aqui propostos têm como objetivo a caracterização da população oocitária quanto a configuração da cromatina nas raças Holandesa e Nelore, além da validação de uma estratégia para obtenção de oócitos homogêneos de doadoras Holandesas com e sem a associação da fase pré-MIV do Sistema Folicular na modulação do estágio de vesícula germinativa (GV – “germinal vesicle”). Este projeto direciona o estudo para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de protocolos para a sincronização ovariana das vacas doadoras e para os cultivos sequenciais, que buscam mimetizar as condições intrafoliculares visando melhorar as taxas de blastocisto tanto em quantidade quanto em qualidade.
Biosusceptometria de corrente alternada para avaliação da contratilidade uterina em ratas prenhes
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-02-25) Simões, Luís Gustavo de Oliveira; MIranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A contração uterina é um processo fisiológico espontâneo com impacto direto no ciclo menstrual/estral e na gestação. Disfunções na atividade uterina estão relacionadas com infertilidade, abortos e partos prematuros, sendo este último a maior causa de mortalidade e morbidade infantil no mundo. Sendo assim, se faz necessário o desenvolvimento de metodologias in vivo para monitorar o processo mecânico uterino. O objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de Biosusceptometria de Corrente Alternada para avaliação in vivo da atividade mecânica uterina em ratas prenhes. Foram utilizadas 40 ratas fêmeas Wistar prenhes com idade entre 10 e 15 semanas e com peso médio de 250 g. Através da Biosusceptometria de Corrente Alternada, 18 animais foram utilizados para avaliação da contratilidade uterina durante a prenhez e 8 foram usadas para avaliação da atividade uterina frente à ação da ocitocina. Na primeira etapa foi realizada uma cirurgia de fixação do marcador magnético em três posições da serosa uterina: próximo ao ovário; na região média entre o ovário e a cérvice; e próximo à cérvice. A atividade uterina foi monitorada nos dias 0, 7, 14, 20 e 21 de prenhez para cada posição do marcador. Na segunda etapa, foi realizado o implante do marcador magnético somente próximo à cérvice, e a atividade foi avaliada antes e depois da administração de ocitocina no dia 20 de prenhez. Os resultados obtidos foram perfis de contração para cada situação proposta, os quais apresentaram contrações basais de alta e baixa frequência e contrações intensas. Durante a evolução da prenhez, foi observado uma atividade discreta e irregular no primeiro terço, quiescência no segundo terço, transição no dia 20 e atividade intensa regular pré-parto. A ocitocina provocou a excitação da atividade uterina por meio da indução de contrações intensas e regulares, revelando um perfil similar ao obtido no dia 21 de prenhez. A análise dos resultados mostrou que o útero exibe perfis de contração distintos em cada etapa da prenhez, bem como uma evolução da atividade contrátil visando o desenvolvimento e expulsão do feto. Este trabalho fornece uma nova ferramenta para contribuir com novos estudos de patologias, hormônios e medicamentos que alterem a contratilidade normal uterina durante a gestação.
Image processing for enhancement of ischemic stroke in computed tomography examinations
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-02-25) Alves, Allan Felipe Fattori [UNESP]; Pina, Diana Rodrigues [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O acidente vascular cerebral (AVC) é uma das maiores causas de morte em todo o mundo. No Brasil, o AVC é a principal, sendo que em 2009, foi responsável por 10,2% das mortes registradas. A tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética nuclear (RMN) são as duas principais técnicas de imagem usadas para detectar o AVC. A TC tem um custo menor e maior acessibilidade da população, por isso ainda é o principal método de avaliação do acidente vascular cerebral. A avaliação do cérebro comprometido é realizada de forma subjetiva e pode levar à dificuldades no diagnóstico. Esta pesquisa propõe a implementação de um algoritmo computacional, destacando regiões de AVC isquêmico. Diferentes métodos de processamento de imagem foram utilizados para melhorar a visualização do tecido isquêmico. Um conjunto de 41 tomografias retrospectivas obtidas na Faculdade Medicina de Botucatu foram utilizadas, divididas em 25 casos de AVC isquêmico e 16 pacientes controle. Os casos de AVC foram obtidos dentro de 4,5 horas após os primeiros sintomas. Após a seleção dos slices com a possível presença de AVC, tais slices foram somados resultando em um único slice com valores médios de forma a reduzir o ruído. Isto foi seguido por um modelo de decomposição variacional onde se mantiveram componentes de interesse da imagem. O método de maximização de expectativas foi aplicado para gerar imagens melhoradas. Determinamos um teste de desempenho de observadores em um ambiente clínico. A sensibilidade geral da análise observacional foi de 64,5% e aumentou para 89,6% e especificidade foi de 83,3% e aumentou para 91,7% quando usadas imagens originais e realçadas, respectivamente. Estes resultados mostram a importância de uma ferramenta computacional para auxiliar as decisões de neuroradiologia, especialmente em situações críticas, como o diagnóstico de AVC isquêmico.
Quantificação do Volume de Densidade Mamária a partir de Técnicas de Processamento de Imagens em Mamografias Digitais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-02-18) Menegatti Pavan, Ana Luiza [UNESP]; Pina, Diana Rodrigues de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Esta pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento um novo algoritmo objetivo, confiável, reprodutível e de baixo custo para estimar com precisão o percentual do volume de DM (PDM) em mamografias digitais processadas, produzidas por sistema de radiologia computadorizada (CR). Para atingir esse objetivo três etapas foram adotadas: (i) Foi desenvolvido um algoritmo a ser utilizado como pré-processamento da imagem para realçar os tecidos presentes na região periférica da imagem mamográfica. Os resultados obtidos foram comparados com outras metodologias descritas na literatura, utilizando o valor médio dos pixels, skweness, kurtosis e por análise gradativa visual. Dentre os métodos avaliados a metodologia desenvolvida foi a que obteve os melhores resultados; (ii) Foi desenvolvido um algoritmo para segmentar a área do tecido fibroglanduar da imagem mamográfica. A segmentação foi realizada através da otimização da técnica de Fuzzy C-Means with Variable Compactness (FCMVC). As imagens obtidas foram classificadas conforme a área de tecido fibroglandular e comparados com a avaliação do BI-RADS. O resultado dessa comparação apresenta 67,8% de classificação correta, com coeficiente de correlação de Spearman de ρ = 0,618, para p <0,001. A estatística de Bland-Altman não mostrou diferenças significativas (viés de -0,20 ± 1,52) entre os dois métodos. O coeficiente kappa de Cohen foi de 0,47, sugerindo uma concordância moderada; (iii) Finalmente foi utilizada a segmentação e quantificação resultante da aplicação do FCMVC. Nesse procedimento, utilizou-se a relação sinal-ruído diferencial para quantificar o volume de tecido fibroglandular. A partir desta medida, foi estimada a PDM em exames de mamografia. Os resultados obtidos foram comparados com dados obtidos por metodologia de quantificação utilizando exames de ressonância magnética (RM). A regressão linear dos valores PDM por mamografia e RM foi de R2=0,821. A diferença percentual média entre ambas modalidades foi de 3,39±2,69% e o coeficiente de Pearson foi de 0,91, indicando forte associação entre os métodos. A estatística de Bland-Altman não mostrou diferenças significativas entre os métodos. O novo algoritmo desenvolvido nesta pesquisa é objetivo, preciso e de baixo custo. Esse algoritmo pode auxiliar diretamente na prática clínica, na recomendação de rastreamento personalizado, em escolhas de estratégias preventivas para o tratamento de câncer de mama, de modo a avaliar a eficácia de drogas terapêuticas.
Investigação funcional e molecular dos adrenoceptores alfa-1 em modelo experimental de epididimite em ratos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-04-23) Mueller, Andre; Pupo, André Sampaio [UNESP]; Silva, Erick José Ramo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Primordialmente, o epidídimo funciona para proteger e realizar a maturação de espermatozoides. A cauda do epidídimo (CE), região que armazena espermatozoides maduros até a ejaculação, recebe densa inervação de fibras pós-ganglionares simpáticas que liberam noradrenalina para contrair o músculo liso do epidídimo via ativação de adrenoceptores alfa-1A (alfa-1A-ARs). As contrações da musculatura lisa têm papel importante no transporte dos espermatozoides ao longo do ducto epididimário, bem como na contração da CE distal durante a fase de emissão seminal da ejaculação. Recentemente, foi demonstrado que a epididimite, a condição inflamatória do epidídimo, induz aceleração do tempo de trânsito espermático em ratos. Nesta tese, testamos a hipótese de que essa aceleração do trânsito espermático induzida pela epididimite é resultado de alterações na contratilidade do ducto epididimário. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar a contração da CE distal mediada por alfa-1-ARs em um modelo experimental de epididimite aguda induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli em ratos. Após 6 e 24 h da injeção intraductal de LPS (25 µg) para indução da epididimite (in vivo), estudos de contração indicaram que a potência da noradrenalina aumentou ~6 vezes na CE distal inflamada. As contrações induzidas pela noradrenalina foram competitivamente antagonizadas pelo prazosin, um antagonista não-seletivo de alfa-1-ARs, com afinidades semelhantes nos grupos tratados com LPS e salina (pA2~8,90). No entanto, a potência do BMY 7378, um antagonista alfa-1D-seletivo, foi ~50 vezes maior na CE distal tratada com LPS (pA2 LPS = 8,70 vs pA2 Sal = 6,95), produzindo inclinação de Schild menor do que a unidade teórica. Além disso, a buspirona, um agonista seletivo para alfa-1D-ARs, foi ~3 vezes mais potente no grupo tratado com LPS (pEC50 LPS = 4,93 vs pEC50 Sal = 4,36) e as curvas concentração resposta (CCRs) para este agonista foram antagonizadas pelo BMY 7378, com uma potência estimada de ~8,70, consistente com a participação de alfa-1D-AR. Como suporte a esses achados, em segmentos da CE distal incubados com LPS (300 ng/mL) por 4 h in vitro, o BMY 7378 também antagonizou as contrações induzidas pela noradrenalina, produzindo pA2~8,50. Além disso, a oximetazolina (agonista parcial alfa-1A) foi ~6 vezes menos potente em segmentos expostos ao LPS em comparação controle (pEC50 LPS = 6,22 vs pEC50 Sal = 7,00). Interessantemente, em tecidos que foram pré-incubados com PDTC, um inibidor de NFKB, antes do desafio com LPS, o BMY 7378 em baixa concentração foi ineficaz em deslocar CCRs para noradrenalina. Ensaios de RT-qPCR indicaram que os níveis relativos de transcritos para adrenoceptores alfa-1a, -1b e -1d não foram alterados na CE distal com epididimite in vivo. Curvas de inibição da ligação específica de [3H]-Prazosin com ligantes seletivos foram realizadas. Apesar dos resultados comparáveis para prazosin e BMY 7378, sítios de baixa afinidade para RS 100329 (antagonista alfa-1A-seletivo) foram identificados, sugerindo um aumento na população de alfa-1D-ARs na CE distal inflamada. Em conclusão, a epididimite induzida por LPS alterou o subtipo funcional alfa-1-AR no músculo liso da CE distal, resultando em uma população heterogênea de receptores (alfa-1A e alfa-1D-ARs) envolvidos na resposta contrátil durante a inflamação aguda. A co-participação dos alfa-1D-ARs está correlacionada com a hipersensibilidade da noradrenalina na CE distal inflamada, e parece ser dependente do NFKB. Essa alteração pode cooperar para um aumento na contração do ducto, evitando, assim, a ascensão de bactérias para regiões proximais do epidídimo. Entretanto, isso pode contribuir para a aceleração do trânsito espermático no epidídimo, um efeito deletério para a maturação espermática.

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