Produção de vetores recombinantes para análise das propriedades biológicas e cancerígenas da proteína K1 do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV-8)
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Data
2014-06-25
Autores
Squiavinato, Annie Cristhine Moraes Sousa [UNESP]
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein
O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV
O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV
Descrição
Palavras-chave
Virus do herpes, Kaposi, Sarcoma de, Biologia molecular, Carcinogenese, Vetores genéticos, DNA recombinante, Molecular biology
Como citar
SQUIAVINATO, Annie Cristhine Moraes Sousa. Produção de vetores recombinantes para análise das propriedades biológicas e cancerígenas da proteína K1 do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV-8). 2014. 65 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Medicina de Botucatu, 2014.