Dissertações - Biotecnologia - IBB

URI Permanente para esta coleção

https://hdl.handle.net/11449/148659

Navegar

Agora exibindo 1 - 20 de 55

Análise proteômica de células humanas in vitro expressando a oncoproteína LMP1 do vírus de Epstein-Barr (EBV)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-26) Gandin, César A.; Oliveira Neto, Mario de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A espectrometria de massas (MS) apresenta um grande potencial para a análise de sistemas biológicos complexos. O desenvolvimento de novas tecnologias de ionização e detectores, transformaram a MS na robusta técnica que é hoje, podendo ser utilizada na detecção de biomarcadores, bem como fazer análises de dinâmicas temporais em diferentes contextos biológicos, inclusive em cenários que envolvem infecção e câncer. O termo câncer engloba centenas de doenças que apresentam diversas características epidemiológicas, biológicas e clínicas que envolvem o comprometimento de mecanismos homeostáticos, fundamentalmente expresso por exacerbação das taxas de proliferação celular e redução das taxas de morte celular. Variados são os fatores etiológicos da doença, destacando-se hábitos alimentares, tabagismo, além de um componente infeccioso. A infecção pelo vírus de Epstein-Barr (EBV) é digna de destaque devido à sua virtual onipresença e elevado potencial oncogênico. O EBV é um oncovírus que infecta mais de 90% da população mundial adulta e foi primeiramente identificado em células malignas de Linfoma de Burkitt. A infecção pelo vírus é atualmente associada a diversas neoplasias e a expressão de diversos produtos virais vêm sendo relacionada a seu potencial oncogênico. Nesse contexto, a proteína viral LMP1 vem sendo descrita como um dos principais fatores responsáveis por essa característica do EBV, pois confere um alto potencial tumorigênico às células que as expressam. Neste trabalho, células humanas HEK293 foram transientemente transfectadas para a expressão de LMP1 e após 72h as proteínas totais foram sequenciadas e quantificadas por MS. Análises de expressão diferencial revelaram 129 proteínas diferencialmente expressas na presença de LMP1, sendo 90 com Fold Change > 2. Análises funcionais das proteínas detectadas revelaram potenciais mecanismos de interação da LMP1 com a célula hospedeira mediante regulação positiva das proteínas rac1, p53, CDK1, ITGB1 e Arp2. A desregulação de tais proteínas podem ser fatores relevantes no processo de tumorigênese deflagrado pelo EBV.
Avaliação da imobilização de anticorpos anti-enterotoxina estafilocócica A em óxido de grafeno reduzido
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-29) Rocha, Giovanna da Silva; Cesarino, Ivana [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O óxido de grafeno reduzido (rGO) é um material alótropo de carbono que apresenta características estruturais que o torna uma alternativa relevante como suporte de imobilização de anticorpos para a construção de biossensores. A estratégia de construção de imunossensores deve levar em consideração as características da superfície do transdutor (rGO), assim como a do componente biológico (antígeno/anticorpo) imobilizado no material de suporte, principalmente para a manutenção da atividade imunológica dos mesmos juntamente a sua especificidade. Neste trabalho, foram avaliados diferentes métodos de imobilização do anticorpo anti-Enterotoxina Estafilocócica A (anti-SEA), com o intuito de construir um imunossensor para detecção da SEA em amostras de leite. A SEA é uma toxina secretada por Staphylococcus aureus que está associada a intoxicações alimentares decorrentes da ingestão de alimentos contaminados por essa bactéria. Desta forma, utilizando eletrodos de carbono vítreo modificados com rGO e com os agentes de bioconjugação pireno-NHS e EDC-NHS avaliou-se a capacidade de imobilização do anticorpo anti-SEA na superfície do transdutor. A caracterização eletroquímica dos biossensores foi realizada utilizando as técnicas de Voltametria Cíclica (CV), no intervalo de potencial de - 0,3 V a + 0,9 V vs. Ag/AgCl com velocidade de varredura de 0,1 V s-1 e por Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS), com frequência variante do espectro de 105 a 101 Hz e 5 mV de amplitude. Ambas as técnicas foram realizadas em uma solução 0,1 PBS (pH 7,0) contendo 0,1 mol L-1 KCl e 5,0 mmol L-1 da sonda redox [Fe(CN)6] 3-/4-. Assim, comparou-se três métodos de imobilização: 1) Adsorção física; 2) Bioconjugação com pireno-NHS e 3) Bioconjugação com EDC-NHS. Os resultados evidenciaram que, apesar dos agentes de bioconjugação serem vantajosos para auxiliar na imobilização orientada, para o anticorpo estudado o método adsortivo teve um melhor desempenho. Dessa forma, a utilização do rGO se apresenta como uma alternativa vantajosa ao processo de construção de biossensores eletroquímicos, evidenciando o potencial de aplicação em escala industrial em imunossensores, visto que a manutenção da estabilidade e atividade dos anticorpos imobilizados na superfície do rGO sem a utilização de agentes de imobilização implicam na redução de etapas e de custo na fabricação do imunossensor.
Identificação de novas vias de disfunção endotelial associadas à pré-eclâmpsia
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-28) Mattioli, Sarah Viana [UNESP]; Sandrim, Valéria Cristina [UNESP]; Krieger, José Eduardo; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A pré-eclâmpsia (PE), uma das principais síndromes hipertensivas da gravidez, está associada a elevados níveis de morbidade e mortalidade materna-fetal, e sua causa permanece desconhecida. A disfunção endotelial (DE) materna, está associada a fatores circulantes libertados pela placenta isquêmica na circulação, mas a sua avaliação depende da recapitulação de forças físicas tais como diferentes padrões de stress de cisalhamento (SS, do inglês shear stress) que afetam a função e disfunção do endotélio. Estudos prévios avaliaram a incubação in vitro de células endoteliais com plasma de pacientes com PE, mas sem ter em conta os diferentes padrões de SS. Para preencher esta lacuna da literatura, desenvolvemos um estudo para avaliar os efeitos do plasma de pacientes com PE, hipertensão gestacional (GH) e do plasma de gestantes saudáveis (HP) sobre a função das células endoteliais sob shear stress laminar (LSS) e oscilatório (OSS). Nós avaliamos as alterações nas vias celulares enriquecidas na análise global do perfil de expressão genica destas células expostas às amostras de plasma de PE, GH e HP sob as duas condições SS, em comparação com um grupo controle sem tratamento com plasma (CT). Os nossos dados indicaram que existe uma dependência dos padrões de SS nos efeitos causados pelos três tratamentos de plasma na modulação das vias celulares avaliadas pelo transcriptoma global em células endoteliais coronárias humanas (HCAECs). Sob LSS, todos os tratamentos diferem, e observamos a diferença entre os grupos de PE e GH. Houve também diferenças entre os grupos associados à hipertensão e HP. Sob OSS, o transcriptoma da células tratadas com plasma de PE e GH apresentam um perfil muito semelhante com relação ao tratamento com plasma de HP. Sob LSS, a exposição ao PE plasmático resultou principalmente na ativação de genes associados à resposta inflamatória, stress do retículo endoplasmático e transição endotelial para mesenquimal (EndMT). Sob OSS, as HCAEC expostas aos três tratamentos plasmáticos tinham um perfil de expressão de genes muito semelhante com algumas ocorrências raras que poderiam indicar que os plasmas de PE e GH poderiam ter um nível de DE aumentado, como níveis aumentados de expressão de IL1B. As vias associadas à DE também apresentaram valores de p ajustados e odds ratio mais elevados do que os outros dois tratamentos de plasma para EndMT e TNF-α sinalização através de NF- κB, indicando que o plasma de PE poderia exacerbar estes processos mais do que os outros dois tratamentos no OSS. Em geral, os nossos dados salientam a importância das vias dependentes de SS na gênese e manutenção da DE, com efeitos particularmente pronunciados nos HCAECs tratados com plasma de PE.
Marcadores de hipóxia e sobrevivência em células endoteliais sob modelo de shear stress respondendo ao meio condicionado por ligas de Cobalto-Cromo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-30) Machado, Mariana Issler Pinheiro [UNESP]; Zambuzzi, Willian Fernando [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O osso é um tecido conjuntivo especializado, altamente dinâmico e capaz de se restabelecer quando acometido em pequenas lesões. Por outro lado, em lesões maiores (tamanho crítico), é necessário intervenções terapêuticas para recuperar-se. Neste contexto, muito se tem discutido sobre aplicações conceituais de bioengenharia de tecidos na busca por novas alternativas, em detrimento dos procedimentos tradicionais e atualmente utilizados na clínica. Tais procedimentos envolvem, sobretudo, o uso de material autógeno para o preenchimento destas lesões. Apesar dos aspectos positivos, fatores como segundo sítio cirúrgico, quantidade e qualidade do material, período de convalescença do paciente e aumento de custo público, reforçam a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Embora ligas de titânio venham sendo amplamente utilizadas com resultados clínicos já estabelecidos, novas ligas vêm sendo propostas no intuito de melhorar essa performance biológica; dentre elas a liga Cobalto-Crômio (CoCr) tem ganhado destaque. Há mais de 20 anos, nosso grupo de pesquisa investiga novos biomateriais osteo-substitutos e processos a serem aplicados em bioengenharia e mais recentemente, tem se intensificado a aplicação de recursos metodológicos de vanguarda para desvendar mecanismos de transdução de sinais que regem a adesão e diferenciação de osteoblastos, dois processos celulares fundamentais para estimular a regeneração do osso. No entanto, muito pouco tem sido reportado sobre o efeito desses materiais em células do endotélio, tampouco reunindo informações moleculares que envolvam mecanismos de hipóxia (mecanismo conhecido capaz de guiar processos de angiogênese). Desta forma, o objetivo deste será avaliar a resposta biológica de células endoteliais (HUVECs) a biomateriais a base de CoCr, sobretudo olhando para o comportamento celular frente a expressão do gene HIF e sua capacidade de reciclagem via proteassoma. Para tanto, o meio condicionado dos biomateriais (condicionado por 24 horas; ISO10993-5:2016) foi utilizado para o tratamento de células endoteliais por 72 horas, as amostras foram coletadas para as análises biológicas. Para validar a importância da via proteassômica, foi inibida com MG32. Conclui-se que ligas de CoCr promovem a viabilidade e atividade de células endoteliais, assim como a ação mimética do shear stress, ambos ativam o mecanismo de Hif-1α, que apresenta um potencial para ser utilizado em momentos futuros da medicina personalizada, por exemplo.
Estratégias analíticas e bioanalíticas aplicadas ao estudo metaloproteômico do mercúrio
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-30) Almeida, Emerson Carlos de; Padilha, Pedro de Magalhães [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O presente trabalho está inserido na recente linha de pesquisa “metaloproteômica do mercúrio”, que tem como principal objetivo a identificação de biomarcadores de exposição às espécies mercuriais. A dissertação foi redigida em três capítulos. Capítulo I: Descreve o estado da arte do estudo realizado, pontuando a importância da otimização de estratégias para quantificar/identificar espécies mercuriais e das estratégias bioanalíticas aplicadas na metaloproteômica do mercúrio. Capítulo II: Descreve os resultados obtidos na otimização de amostragem de fluídos biológicos utilizando percolação em cartões Noviplex para posterior determinação de mercúrio total. Para isso, estratégias de amostragem de sangue de peixes/humanos e de extratos proteicos de tecido muscular e hepático de peixes por percolação em cartões Noviplex foram ajustados. Na etapa de quantificação do mercúrio nos eluatos das amostras, os parâmetros físico-químicos relacionados a estabilização térmica do mercúrio para posterior determinação por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) foram otimizados. O método foi validado por meio de análise de material certificado. Este capítulo foi redigido na forma de artigo científico, nas normas do periódico Exposure and Health. Capítulo III: Descreve os resultados obtidos no estudo metaloproteômico de tecido renal de ratos expostos a baixas concentrações de cloreto de mercúrio por trinta e sessenta dias. O perfil proteômico do tecido renal dos ratos foi obtido por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e as determinações de mercúrio total no tecido hepático, pellets proteicos e spots proteicos foram realizadas por GFAAS. A caracterização dos spots proteicos associados ao mercúrio e análise de proteínas diferencialmente expressas foi feita por espectrometria de massa em sequência com ionização por electrospray acoplada com cromatografia líquida (LC-ESI-MS/MS). Análise de bioinformática das proteínas identificadas como diferencialmente expressas foram feitas utilizando o software Blast2GO e permitiram elucidar aspectos fisiológicos e funcionais das Hg-metal binding protein e inferir possíveis biomarcadores de exposição ao mercúrio. Este capítulo foi redigido na forma de artigo científico, nas normas do periódico Biological Trace Element Research.
Efeitos parácrinos e metabólicos do meio enriquecido com cobalto em células endoteliais e osteoblastos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-30) Teixeira, Suelen Aparecida [UNESP]; Willian, Fernando Zambuzzi [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As ligas à base de cobalto-cromo (CoCr) surgiram como um biomaterial interessante acerca do campo biomédico, principalmente considerando sua biocompatibilidade, resistência à corrosão e ausência de magnetismo; entretanto, seu efeito no metabolismo celular é pouco conhecido e isso nos levou a avaliar melhor se o meio enriquecido com CoCr afeta o metabolismo tanto de osteoblastos quanto de células endoteliais, e também se há um acoplamento entre elas. Também foi considerado aqui o efeito já conhecido do Cobalto (Co) como um elemento hipóxico, estabelecendo um modelo in vitro importante. Discos de CoCr foram incubados em meio de cultura livre de Soro Fetal Bovino (FBS) por 24 horas. Este meio enriquecido com CoCr foi utilizado para tratar culturas de células endoteliais sob tensão de cisalhamento por 72 horas. Depois disso, o meio condicionado contendo metabólitos de células endoteliais foi ainda utilizado para submeter as culturas de osteoblastos, quando as amostras foram adequadamente colhidas para permitir a análise moleculares. Nossos dados mostram que o meio enriquecido com CoCr contém 1,5-2,0ng/mL de Co, que foi capturado pelas células endoteliais e osteoblastos em cerca de 30% em quantidade e parece modular suas vias metabólicas: as células endoteliais expressaram maior perfil dos genes HIF1α, VEGF e nNOS, enquanto seu perfil global de carbonilação proteica foi inferior ao das culturas de controle, sugerindo menor comprometimento com o estresse oxidativo. Além disso, os osteoblastos respondendo aos metabólitos das células endoteliais com CoCr apresentam expressão dinâmica dos genes marcadores na diferenciação osteogênica, como genes da fosfatase alcalina (ALP), osteocalcina e sialoproteína óssea (BSP), estando significativamente aumentados. Além disso, as forças de tensão de cisalhamento diminuem o estímulo à expressão do ColA1 gene nos osteoblastos respondendo aos metabólitos das células endoteliais, bem como modulação importante de genes relacionados à remodelação da matriz extracelular. Por fim, analisando as atividades das metaloproteinases de matriz (MMPs), os dados mostram que os metabólitos das células endoteliais com tensão de cisalhamento aumentam as atividades tanto do MMP9 quanto do MMP2 nos osteoblastos. Ao todo, nossos dados mostram pela primeira vez que os metabólitos de células endoteliais respondendo aos discos CoCr contribuem para o fenótipo osteogênico in vitro, e isto prediz uma interação ativo entre a angiogênese e a osteogênese durante a osseointegração da liga CoCr, podendo ser relacionada em mecanismos de regeneração do osso, guiado pela condição de hipóxia experimental provocado pelo cobalto.
Adsorção de metais pesados em amostras aquosas utilizando partículas de PVC modificadas com sulfanilamida
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-29) Almeida, Giliardi Marinho de; Castro, Gustavo Rocha de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Um dos estudos da engenharia química é o desenvolvimento e aplicação de técnicas para extração de espécies metálicas em meio aquoso. Sempre esteve em evidência e principalmente nas últimas décadas com a contaminação dos recursos naturais e principalmente dos corpos de água. Um dos métodos mais utilizados para esta finalidade é a adsorção, tendo importância para o processo de purificação e separação. Desde o início do século, a técnica de adsorção tem sido objeto de interesse dos pesquisadores, tendo aplicação na proteção ambiental e nas indústrias com intuito de minimizar os seus efluentes ao meio ambiente. Os metais pesados estudados na presente pesquisa foram: Cobre (Cu) e Cobalto (Co); são de interesse ambiental em razão de seu uso intensivo, distribuição e por serem não-degradáveis, podendo acumular-se em matrizes ambientais manifestando toxicidade. Desta forma, a dissertação teve como objetivo sintetizar um material capaz de adsorver espécies metálicas de amostras aquosas utilizando partículas de Policloreto de Vinila (PVC) como adsorventes funcionalizado com sulfanilamida. O material foi caracterizado por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) com o qual constatou a presença de bandas na região do espectro característica do PVC-funcionalizado, que vai de 1500 a 1640 cm-1. São destacadas duas bandas intensas, as quais são atribuídas as vibrações do tipo “tesoura”, de grupamento amina (NH2). Esses resultados podem ser indicativos de que a funcionalização ocorreu com sucesso. Já o experimento de Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios-X (XPS) que corroborou com as análises anteriores indicando a presença de grupos referentes ao ligante sulfanilamida no PVC-funcionalizado. Na determinação de Ponto de Carga Zero (pHpzc), verificou-se a ocorrência da reação de modificação, sendo possível a construção de um modelo. Estudos de adsorção foram realizados para determinação de tempo equilíbrio, influência do pH e capacidade máxima de adsorção do material. O tempo mínimo de contato foi de 40 minutos para os metais Cu e Co, ou seja, uma cinética rápida, alcançando o equilíbrio em poucos minutos de contato. Apresentou maior adsorção em pH próximo de 6, para ambas as espécies metálicas e a capacidade máxima de sorção de íons metálicos determinada experimentalmente para o PVC funcionalizado foi de 0,33 mmol g-1 para o Cu e 0,25 mmol g-1 para o Co.
Padronização de protocolo utilizando partículas magnéticas para extração de DNA do circovírus suíno (PCV)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-26) Silva, Bruna Lindolfo da; Araújo Junior, João Pessoa [UNESP]; Basso, Caroline Rodrigues; Cruz, Taís Fukuta; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Brasil ocupa o quarto lugar no ranking mundial de exportação de carne suína e para alcançar tais índices zootécnicos, os produtores necessitam do controle de várias doenças emergentes em suínos, sendo a identificação e prevenção fatores essenciais. Dentre as principais doenças, destaca-se a circovirose suína, tendo o circovírus suíno 2 (PCV-2) como agente etiológico. O diagnóstico da circovirose suína se dá por meio dos sinais clínicos associados a testes laboratoriais. A utilização da PCR quantitativa (qPCR) para a determinação da concentração do DNA viral vem sendo considerada o método de escolha neste contexto devido ao alto poder de detecção e na rapidez para obtenção dos resultados. Entretanto, a aplicabilidade desta técnica a torna problemática, devido ao alto custo para a aquisição dos insumos. Um dos principais fatores associados ao elevado custo é a utilização de kits comerciais para extração do ácido nucleico. Grande parte desses insumos são adquiridos pela importação, o que além de refletir no aumento do valor devido a logística, podem ocasionar problemas na produção devido a fatores externos como alta demanda e falta de matéria prima. Com isso, este trabalho teve como objetivo padronizar uma metodologia simples para a extração de DNA, a fim de proporcionar a otimização das análises moleculares para o diagnóstico do PCV em diferentes amostras. O protocolo desenvolvido foi aplicado em amostras de saliva, sangue total e soro de suínos infectados naturalmente. Os produtos das extrações utilizando o protocolo desenvolvido foram submetidas às análises de qPCR para a quantificação do DNA do PCV. Adicionalmente, a análise de integridade do ácido nucleico pela espectrofotometria UV-Vis foi realizada para obtenção dos dados de pureza do material extraído. Dois kits comerciais, um baseado na metodologia de extração por coluna de sílica e o outro por partículas magnéticas, foram utilizados a fim de comparar a eficiência do protocolo proposto. Os protocolos desenvolvidos neste trabalho apresentaram eficiência similar aos kits comerciais para a extração de DNA do PCV para os três tipos de amostras. Todos os protocolos de extração adotados apresentaram baixa pureza em relação às razões 260/280 e 260/230, porém tal fato não interferiu na análise por qPCR. Fatores como simplicidade de execução e possibilidade de automação favorecem a sua utilização.
Avaliação do uso de folhas de amora (Morus nigra L.) como biossorvente para adsorção de cobre e zinco de amostras aquosas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-18) Silva, Toncler da; Castro, Gustavo Rocha de [UNESP]; Saeki, Margarida Juri [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A contaminação dos recursos hídricos, seja por substâncias orgânicas ou inorgânicas, é um problema ambiental evidente e discutido mundialmente. A manutenção ou melhoria dos recursos hídricos é essencial à necessidade abrangente da humanidade por alimentos e segurança energética. Tendo em vista a necessidade de remoção de espécies metálicas de amostras aquosas, procedimentos/técnicas vêm sendo adotadas, dentre elas a extração em fase sólida. Visando diversificar as opções de materiais disponíveis para a adsorção (principalmente, buscando diminuir o custo do procedimento), a utilização de biossorventes se tornou um atrativo. Sendo o principal objetivo do presente trabalho a utilização da folha de amora (Morus nigra L.) como material para tratamento de amostras contaminadas com metais, buscando aproveitar esta matéria-prima. Além disso, caracterizar o material a fim de identificar os grupos químicos utilizando a Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), elucidar a estrutura do material, utilizando a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com polarização cruzada, caracterizar a composição química do adsorvente pelo método de análise elementar, determinar o pH no qual a superfície do adsorvente possui carga nula (pHpzc). Resultados referentes ao espectro de FTIR e RMN identificaram os grupos químicos funcionais responsáveis pela interação entre o biossorvente e analito, sendo a folha de amora um material rico em celulose. A análise elementar detectou 23 g kg-1 de nitrogênio e 0.9 g kg-1 de enxofre presentes no material. Juntamente, o teste de pHpzc ajuda a entender a melhor faixa de pH para os experimentos, sendo o ponto de carga zero da folha de amora o pH 8.7. O material foi aplicado em estudos de adsorção em função do tempo mínimo de contato, pH e da capacidade máxima de sorção dos íons Cu(II) e Zn(II), os estudos comprovaram que o tempo mínimo de contato foi de 30 minutos para o cobre e zinco, seguindo o modelo de pseudo-segunda ordem, o pH ideal para a adsorção de cobre se deu próximo de 6 e entre 4 e 6 para zinco, no estudo de capacidade máxima foi demonstrado que cada grama de biossorvente conseguiu adsorver 0.37 mmol de íons de Cu(II) e 0.50 mmol de íons Zn(II), seguindo a isoterma de Langmuir, demonstrando que a adsorção acontece em monocamada do material biossorvente.
Caracterização isotópica para avaliar autenticidade de óleos vegetais refinados comercializados no Brasil
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-28) Gimenes, Samuel Perri; Costa, Vladimir Eliodoro [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Este trabalho buscou caracterizar isotopicamente os óleos vegetais refinados de milho, girassol, canola, soja, algodão e dendê comercializados no Brasil. Houve uma desvalorização da moeda brasileira, desestabilizando o mercado de exportação de grãos utilizados para produção dos óleos a serem analisados. Quando o mercado externo se torna mais interessante e lucrativo, espera-se um déficit no fornecimento da matéria prima para o mercado interno, gerando motivação econômica para adulteração de produtos, onde o óleo de soja é o principal adulterante, por ser mais barato, seguido do óleo de milho. A caracterização dos óleos através da espectrometria de massa de razão isotópica permitiu estabelecer valores esperados para cada tipo de óleo, podendo servir como banco de dados para avaliação da autenticidade. Dessa maneira, a análise isotópica pode se tornar uma ferramenta rápida para avaliação da autenticidade de óleos vegetais refinados. Os resultados apresentados nos permitiram caracterizar com facilidade o óleo de milho devido ao seu ciclo fotossintético, e o óleo de canola devido a região onde é produzido.
Estudo do fluxo de prótons em Saccharomyces cerevisiae sob estresse etanólico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-02) Pinto, Camila Moreira; Valente, Guilherme Targino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Saccharomyces cerevisiae é amplamente utilizada na produção de bioetanol e as elevadas concentrações de etanol durante a fermentação representam um dos estressores mais comuns que afetam inicialmente a membrana citoplasmática. Entretanto, o conhecimento acerca da dinâmica dos compartimentos da membrana plasmática em S. cerevisiae sob estresse etanólico é incipiente. Aqui, objetivou-se buscar por características que contribuam para a melhor compreensão da dinâmica dos compartimentos eisossoma e MCP em resposta ao estresse etanólico em S. cerevisiae. Durante 240 min, células da linhagem BY4741 foram expostas a diferentes concentrações de etanol e analisou-se a acidificação do meio extracelular, taxa de crescimento, sublocalização celular de proteínas e análises da expressão gênica e proteica. Os resultados mostraram que o etanol tem influência na interação entre os compartimentos MCP e eisossoma, afetando diretamente o fluxo de prótons entre a célula e o meio externo e o nível de interferência é norteado pelo percentual de etanol. Adicionalmente, a redução da Pma1p (MCP) em células sob estresse por etanol corrobora a baixa atividade de fluxo de prótons. O aumento de eisossomas juntamente com o aumento de Can1p e Xrn1p sugerem um papel protetor e regulador do eisossoma durante o estresse por etanol. Por fim, demonstramos o aumento de grânulos de estresse vinculado ao aumento de eisossomas durante o estresse por etanol. Em suma, reportamos algumas características-chave para a compreensão da dinâmica dos compartimentos eisossoma e MCP em resposta estresse etanólico, evidenciamos a importância da interação entre os compartimentos de membrana plasmática com vias regulatórias responsáveis pelo homeostase iônica intracelular e degradação de mRNA e sugerimos que eisossomas podem representar uma importante resposta celular adaptativa ao estresse por etanol.
Avaliação do impacto da inativação de genes associados ao estresse celular em Saccharomyces cerevisiae
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-04) Cardoso, Luiz Henrique; Valente, Guilherme Targino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A demanda mundial por energia tem se tornado um dos maiores desafios da atualidade. Junto a isso, temos a crescente demanda por sustentabilidade que tem estimulado o desenvolvimento de tecnologias para substituição do uso de combustíveis fósseis. Desta forma, os biocombustíveis, sendo o bioetanol um dos mais evidentes, têm tomado espaço no mercado econômico e, com isso, alavancado pesquisas nessa área. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido exaustivamente estudada, tornando-se assim um organismo modelo. Dentre as muitas propriedades desta, algumas a tornam ideal para estudos referentes à tolerância ao etanol e à termotolerância, problemas encontrados durante a fermentação em escala industrial. Muitas pesquisas buscam aumentar a tolerância desses organismos a estressores, portanto, diversos métodos são estudados e utilizadas para isso. Nesse contexto, utilizou-se a técnica de edição gênica, do tipo CRISPR-Cas9, para realizar a inativação de genes candidatos à tolerância ao etanol e à temperatura e gerar novas linhagens potencialmente mais tolerantes a esse composto, a fim de melhorar o atendimento às necessidades industriais. Estes estudos permitiram visualizar que a inativação de certos genes leva ao decréscimo da capacidade de suportar o estresse ao etanol, além de alterar a capacidade de tolerância térmica nesses mutantes. Com isso pode-se visualizar a relevância da inativação de determinados genes na busca pela melhoria dos processos fermentativos, podendo-se melhorar o teor alcoólico do processo, minimizar os custos da etapa de recuperação do etanol, auxiliar no aumento de produção através de concentrações maiores de açúcar no início do processo, reduzir o custo com trocadores de calor que são utilizados durante o processo e reduzir a contaminação por leveduras selvagens e bactérias durante o processo.
Estudo dos polimorfismos genéticos da arginase na pré-eclâmpsia
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-16) Pinto-Souza, Caroline Cristina; Sandrim, Valéria Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A pré-eclâmpsia (PE) se encontra associada à redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO). A arginase se relaciona à síntese de NO, porém, é relativamente inexplorada na PE. No entanto, nenhum estudo anterior examinou se as variações nos genes ARG1 e ARG2, que codificam a arginase, afetam a biodisponibilidade do NO e o risco de desenvolver PE. Neste trabalho, comparamos a frequência dos alelos e genótipos de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em ARG1 (rs2781659; rs2781667; rs2246012; rs17599586) e ARG2 (rs3742879; rs10483801) em mulheres grávidas saudáveis (GS) e PE, e examinamos se estes SNPs afetam as concentrações plasmáticas de nitrito (um marcador da formação de NO) nestes grupos. Também verificamos se haveria modulação dos níveis plasmáticos da arginase e nitrito pelos polimorfismos em mulheres com PE responsivas ou não à terapia anti-hipertensiva. Os genótipos para os SNPs de ARG1 e ARG2 foram determinados pela sonda Taqman, o nitrito do plasma, por um ensaio de quimioluminescência baseado em ozônio. As concentrações das isoformas de arginase foram medidas em amostras de plasma usando kits ELISA disponíveis comercialmente. Em relação aos SNPs de ARG1, as frequências dos portadores de G para rs2781659, e as frequências do alelo C para rs2246012 foram maiores na PE em comparação com mulheres GS. Além disso, o genótipo GG de rs2781659 e o genótipo TT de rs2781667 foram associados ao nitrito plasmático mais elevado em GS. Nossos resultados sugerem que os SNPs de ARG1 aumentam a susceptibilidade à PE e modulam o nitrito plasmático a níveis elevados em mulheres GS. Além disso, o SNP rs3742879 de ARG2 está associado à não responsividade e modula os níveis de arginase 2 e nitrito. Enquanto os polimorfismos de ARG1 não têm esse efeito.
Caracterização funcional dos long non-coding RNAs (lncRNAs) de Saccharomyces cerevisiae na tolerância ao etanol
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-01-21) Schnepper, Amanda Piveta; Valente, Guilherme Targino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Saccharomyces cerevisiae é a levedura responsável por grande parte dos processos fermentativos do cotidiano, principalmente a produção de etanol como combustível. Dado o aumento da demanda de uso do etanol, cada vez mais a engenharia genética tem sido usada para entender o metabolismo das leveduras, elucidar as regulações envolvidas nas vias de produção de etanol e melhorar o desempenho das leveduras na fermentação. Neste trabalho, iremos explorar os lncRNA responsivos ao estresse por etanol do ponto de vista funcional. LncRNAs são moléculas de RNA com mais de 200 nt e que normalmente não codificam proteínas. Estes RNAs atuam regulando o metabolismo das células por meio de regulações transcricionais ou traducionais, uma vez que possuem a capacidade de interagir com DNA, RNA e proteínas. Experimentos de modelagem em tripla-hélice mostraram um potencial dos lncRNAs em interagir com a região promotora de diversos genes de S. cerevisiae, atuando tanto na sobre-expressão quanto na sub-expressão destes genes. O KO do transcr_9136 reduziu a tolerância ao etanol e alterou a expressão dos genes RRP1 e ILT1, vizinhos a este lncRNA. Na linhagem BY4742, o KO do transcr_10027 resultou em alterações no crescimento, redução da tolerância ao etanol e diferenças significativas nos mecanismos de resposta ao estresse, como a formação de P-bodies e grânulos de estresse. Desta forma, reporta-se a importância das regulações mediadas por lncRNAs no metabolismo das leveduras, o que pode contribuir para estudos posteriores e orientar experimentos de engenharia genética.
Caracterização metabólica de quinze subprodutos da cadeia produtiva do café: das fazendas aos processos industriais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-02) Silva, Mariana Rodrigues da; Funari, Cristiano Soleo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Aproximadamente 11,4 milhões de toneladas de subprodutos sólidos e uma crescente quantidade de águas residuais serão geradas durante a safra de café de 2020/21. Atualmente, não há usos que realmente agreguem valor para esses subprodutos que potencialmente ameaçam o meio ambiente. Este trabalho apresenta a investigação química mais abrangente de subprodutos do café coletados das fazendas às fábricas, incluindo oito nunca investigados anteriormente. Vinte compostos foram encontrados pela primeira vez em subprodutos do café, incluindo bioativos, como: neomangiferina, kaempferol-3-O-rutinosídeo, lup-20(29)-en-3-ona e ácido 3,4-dimetoxicinâmico. Cinco subprodutos gerados dentro de uma fábrica apresentaram teores de cafeína (53,0-17,0 mg.g-1) e/ou ácido clorogênico (72,9-10,1 mg.g-1) comparáveis aos grãos de café, enquanto as folhas maduras da poda de plantas apresentaram não apenas alto teor de ambos os compostos (16,4 e 38,9 mg.g-1, respectivamente), mas também de mangiferina (19,4 mg.g-1), além de uma variedade de flavonóides. Esses subprodutos representam uma fonte de uma variedade de compostos bioativos e podem ser explorados com potenciais benefícios econômicos e certamente ambientais
Cultivo da microalga Spirulina platensis marcada com isótopo estável ¹³C usando ¹³CO2
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-20) Cronemberger, Luiz Constantino Abrantes; Costa, Vladimir Eliodoro [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Anormalidades no tempo de esvaziamento gástrico causam complicações que afetam a qualidade de vida em humanos e a cintilografia é o padrão ouro para este diagnóstico. Contudo sua aplicação é restrita devido ao uso do radioisótopo 99mTc. Uma alternativa a este método é o teste respiratório com isótopo estável do carbono. Este teste é um exame que não utiliza radioisótopos, não é invasivo e não possui contraindicação. Sua aplicação varia de acordo com o substrato utilizado, podendo ser empregado a microalga Spirulina platensis marcada com 13C ([13C]-Spirulina platensis). No Brasil, não há a produção desse substrato marcado e o seu alto custo dificulta a aplicabilidade do teste. Assim, neste trabalho foi produzida a [13C]-Spirulina platensis buscando melhor custo-benefício com a utilização do 13CO2 como fonte de 13C. Foram realizados no total quatro cultivos, sendo dois sem marcação, que visavam avaliar a produção sem desperdiçar compostos marcados, e dois com marcação. No processo de produção, a microalga foi cultivada em biorreator com água deionizada, micronutrientes, macronutrientes e NaH13CO3, obtido através do 13CO2. O fotoperíodo, o pH, a temperatura e a agitação foram monitoradas, e após o cultivo, a microalga foi colhida, filtrada, lavada e seca. A produção média da biomassa nos cultivos foi de 2,17 g de S. platensis. A média das produtividades desses cultivos ficou em 0,056 g(L.dia)-1. A [13C]-Spirulina platensis foi analisada por espectrometria de massa de razão isotópica para determinação do enriquecimento isotópico no 13C que foi, em média, de 21,10%. O custo de produção da S. platensis marcada foi 40% menor do valor de compra por importação. Contudo, como o enriquecimento isotópico médio adquirido foi 21,10%, comparado a 97% da importada, o custo de produção da [13C]-S. platensis neste trabalho ficou 84% maior que uma mistura de mesmo enriquecimento isotópico utilizando-se [13C]-S. platensis importada e S. platensis natural.
Perfil bioativo e potenciais aplicações de resíduos de laranja e uva isolados e fermentados
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-07-27) Camargo, Dafne Angela; Fleuri, Luciana Francisco [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A produção de laranjas (Citrus sinensis L. Osbeck) e uvas (Vitis vinifera e Vitis labrusca) são culturas de extrema importância para a economia brasileira. Os resíduos dessas frutas, gerados em grande quantidade no processamento industrial, despontam em vários estudos como fontes de compostos bioativos (enzimas e antioxidantes) interessantes para diversas aplicações biotecnológicas. Os métodos de obtenção das biomoléculas são cruciais para baratear o bioprocesso, assim, os resíduos isolados (utilização direta) e fermentados (utilização indireta) são discutidos como alternativas limpas às tecnologias de síntese química por deterem vantagens sustentáveis e econômicas. As enzimas de alto valor comercial como fitases, lipases e proteases são amplamente utilizadas em processos catalíticos por disporem de propriedades bioquímicas versáteis e com vastos campos de aplicação. O potencial biológico dos resíduos de laranja e uva é ampliado pelas ações antioxidante, antimicrobiana, antidiabética, anti-inflamatória e de modulação celular. Palavras-chave: Citrus sinensis L. Osbeck, Vitis vinifera e Vitis labrusca, enzimas, compostos bioativos, ação biológica.
Desenvolvimento de metodologias verdes na investigação química de resíduos da cultura e do processamento de cana-de-açúcar
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-08-14) Assirati, Julia; Funari, Cristiano Soleo de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As Nações Unidas preconizam pesquisas focadas na conversão de subprodutos agrícolas em recursos úteis para a sociedade, porque esses subprodutos podem contribuir para mudanças climáticas, contaminação da água e do solo e poluição do ar local. Os princípios da Química Verde devem conduzir a investigação de compostos de valor agregado em subprodutos, pois todo desenvolvimento de produto começa na escala analítica. Neste trabalho, nove diferentes abordagens de extração foram investigadas lado a lado para bagaço de cana-de-açúcar, incluindo três métodos de referência. Two-Liquid-Phase Ultrasound-Assisted Extraction with Probe ou Two-Liquid-Phase Dynamic Maceration com uma geometria de frasco adequada e com etanol e n-heptano, considerados mais verdes, compatíveis com análises e de alta disponibilidade, como alternativas para solventes de referência, como metanol e n-hexano, foram as duas melhores abordagens baseadas na extração e no desempenho ambiental. Eles foram aplicados aos três principais subprodutos sólidos do setor sucroenergético. Os extratos hidroetanólico e n-heptânico produzidos foram analisados, respectivamente, por cromatografia líquida de ultra alta eficiência e cromatografia gasosa, ambas acopladas à espectrometria de massas, sem a necessidade de utilizar etapas de preparação de amostra que exigem tempo, energia e consumo de solventes, como evaporação de solventes, concentração de metabólitos, resuspensões e derivatização. Foram identificados 111 compostos em um único subproduto, cobrindo desde a sacarose altamente polar até o apolar n-hexatriacontanal, em um único procedimento de extração. Orientina, apigenina-6-C-glucosilrhamnosídeo, 1-octasonol, octacosanal e outros compostos bioativos foram identificados nesses subprodutos que se encontram abundantemente disponíveis e que, usualmente, são queimados apenas para produzir energia. Esses dois métodos aparecem como procedimentos verdes, simplificados e altamente eficientes para extrair e identificar de forma abrangente subprodutos sucroenergéticos sólidos. Estes métodos podem ser aplicados para obter o perfil metabólico de outros subprodutos ou matrizes sólidas complexas.
Modelagem do ciclo celular e influência dos lncRNAs em Saccharomyces cerevisiae expostas a altas concentrações de etanol.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-06-19) Lázari, Lucas Cardoso; Valente, Guilherme Targino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A intensa utilização de combustíveis fósseis gerapreocupações constantes devido aos impactos de sua combustão ao meio ambiente. Os biocombustíveis são uma alternativa viável aos combustíveis fósseis por apresentarem vantagens como serem menos agressivos ao meio ambiente. O bioetanol é um dos biocombustíveis mais utilizados no mundo e sua produção pode ser feita pela fermentação realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto, altas concentrações de etanol inibem diversos mecanismos biológicos da levedura, causando a diminuição da produtividade. A partir de resultados prévios, observou-se que o ciclo celular é uma das vias mais afetadas pelo etanol e, além disso, constatou-se a presença de lncRNAs regulando esta via emduas linhagens de S. cerevisiae, a BY4742 e SEY6210. Utilizando operadores Booleanos, um modelo lógico discreto foi desenvolvido para o ciclo celular no qual os nós do sistema assumem até quatro valores discretos que representam a quantidade ou o graude ativaçãodesses nós. O modelo desenvolvido apresentou boa performance preditiva, acertando 87.27% dos 109 fenótipos obtidosda literatura, tornando possível a simulação de novos elementos. Experimentos prévios demonstraram que as leveduras de baixatolerância ao etanol conseguem retomar o crescimento mais rápido do que as de alta tolerância. Nesse trabalho, simulações feitas com dados de expressão diferencial via RNA-Seq permitiu inferir que isso ocorre porque as linhagens de baixa tolerância sofrem arrestna última fase do ciclo celular (fase M), enquanto que as mais tolerantes sofrem arrestna primeira fase (fase G1). Os resultados também indicaram que na linhagem SEY6210 (baixa tolerância) a presença de um lncRNA superexpresso permite que esta linhagem complete o ciclo sem sofrer arrest. Até o momento, o modeloaqui desenvolvido contemplao maior número de proteínas do ciclo celular.
Proteases fúngicas: produção utilizando farelo de soja e farinhas de banana, caracterização enzimática e aplicação em farinha de grilo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-03-24) Koike, Meliane Akemi; Fleuri, Luciana Francisco [UNESP]; Bagagli, Marcela Pavan; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resíduos e subprodutos agroindustriais são extensivamente estudados a fim de se reaproveitar seu potencial biológico e agregar valor. A fermentação em estado sólido (FES) é uma das formas de utilizar estes resíduos e subprodutos para obtenção de enzimas, como as proteases. Este trabalho objetivou estudar a produção de proteases fúngicas por FES utilizando farelo de soja e farinhas de banana, caracterizar bioquimicamente as proteases mais promissoras e, por fim, aplicar na hidrólise da farinha de grilo (Gryllus assimilis), avaliando os produtos de hidrólise. O estudo da composição do meio de cultivo foi conduzido através de um delineamento experimental, o planejamento de misturas, para definir a proporção ótima de parte sólida dos substratos de fermentação. Posteriormente, realizou-se a cinética de produção de protease por FES, a caracterização bioquímica das proteases mais promissoras quanto ao pH e temperatura ótimos de atuação, bem como a influência de íons metálicos e L-cisteína em diferentes concentrações. Por meio de relargagem (salting-out), fez-se a purificação parcial das enzimas, seguida de diálise e liofilização, para então serem aplicadas na hidrólise da farinha de grilo. O fator de hidrólise, a atividade antioxidante e o perfil eletroforético dos produtos de hidrólise foram avaliados. O planejamento de misturas resultou em duas proporções com altas atividades proteolíticas, 50 % de farelo de soja (FS) e 50 % de farinha de casca de banana madura (FCBM) e um terço de cada componente estudado (farelo de soja, farinha de casca de banana madura e farinha de banana verde) para os dois micro-organismos estudados: Trichoderma koningii (INCQS 40331) e Aspergillus oryzae (ATCC 1003 / INCQS 40068). Foi possível obter um modelo quadrático apenas para o A. oryzae, com p<0,15. A cinética de produção enzimática em 168 h revelou que em 48 h a atividade proteolítica atingiu o seu máximo, na mistura de substratos contendo 50 % de FS e 50 % de FCBM. Por meio da caracterização bioquímica foram definidos temperatura ótima das proteases de 40oC produzidas por ambos micro-organismos e pH ótimo de 6,0 para protease de T. koningii e pH 7,0 para protease de A. oryzae. Os íons metálicos e L-cisteína não resultaram em efeito positivo na atividade proteolítica. A análise dos sobrenadantes dos hidrolisados obtidos por ação das proteases de ambos fungos revelaram potencial antioxidante, com destaque para os hidrolisados da protease de A. oryzae, correspondente a 101,09 µM de TE. A eletroforese em gel dos hidrolisados indicou proteínas menores que 14,4 kDa, corroborando a ação hidrolítica das proteases do A. oryzae na farinha de grilo. Palavras-chaves: banana, soja, proteases fúngicas, hidrólise, farinha de grilo, antioxidante

Navegar

Submissões Recentes