Structural studies of PLA2-like toxins and development of the structure solution method sequence slider
Carregando...
Data
2017-02-20
Autores
Borges, Rafael Junqueira [UNESP]
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
As fosfolipases A2 (PLA2s) são um dos maiores constituintes protéicos do veneno botrópico e um dos responsáveis pela necrose muscular, consequência esta não eficazmente neutralizada pela administração do soro antiofídico. Estas proteínas são tóxicas através do rompimento ou perturbação da membrana celular em um mecanismo catalítico dependente de cálcio e outro independente, sendo este último não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela co-existência de diferentes isoformas. O objetivo desta tese foi compreender o mecanismo miotóxico independente de cálcio através de estudos estruturais e propor nova metodologia que trate de dados cristalográficos de toxinas provenientes de amostras impuras, chamada SEQUENCE SLIDER. Para tanto, cristalografia e outras técnicas biofísicas, como espalhamento de raios X a baixo ângulo, serão utilizados para estudar três miotoxinas ofídicas em estado nativo e complexado com produtos naturais e inibidores. Nós propusemos medidas locais e globais para caracterizar e relacionar a estrutura dessas toxinas a função. Com o SEQUENCE SLIDER, pudemos elucidar as estruturas de toxinas inéditas cuja sequência era parcialmente conhecida. Esta nova metodologia proposta consiste em avaliar diferentes cadeias laterais contra o coeficiente de correlação em espaço real calculado a partir dos dados cristalográficos. Em paralelo, desenvolvemos o SEQUENCE SLIDER no âmbito do método cristalográfico ab initio ARCIMBOLDO com objetivo de aumentar seu escopo a dados com resolução mais baixa que 2 Å. Nestes casos, diferentes hipóteses de sequências para as soluções parciais de polialanina são avaliadas mutualmente e enviadas a autotraçamento até que grande parte da estrutura seja faseada. Pudemos melhorar a compreensão do mecanismo miotóxico e desenvolver um programa que poderá auxiliar resolução de estruturas cristalográficas desafiadoras.
Phospholipases A2 (PLA2s) are one of the main component of Bothrops genus snakes and one of the main responsible for muscular necrosis in envenomation, a consequence not neutralized by administration of antiophidian serum. These proteins are myotoxic by disrupting membrane phospholipids by a catalytic mechanism dependent of calcium or by perturbing membrane integrity by an independent of calcium mechanism not fully known. Usually, snake toxins are purified directly from the natural source, extracted venom, and purity is a challenge due to the co-existence of various isoforms. The objectives of this thesis were to understand the non-catalytic membrane perturbation mechanism by studying the snake myotoxins and to propose a new crystallographic method to deal with impure samples, called SEQUENCE SLIDER. We performed structural X-ray crystallography studies, complemented with other biophysical techniques, such as small-angle X-ray scattering, with three bothropic myotoxins in apo state and complexed to natural products and inhibitors. We proposed local and global measurements to characterize and relate these states to toxin function. With the method SEQUENCE SLIDER, we aided elucidation of structures with partial sequence known by evaluating different side chain against real space correlation coefficient calculated from diffraction data. Furthermore, we developed SEQUENCE SLIDER to increase the scope of the crystallographic phasing program ARCIMBOLDO to lower resolution than the usual 2 Å. In such cases, different hypotheses of sequences of the partial traces of polyalanine are evaluated simultaneously and pushed through autotracing until the structure is phased. We improved the myotoxic mechanism comprehension and developed a structure solution method for challenging crystallographic structures.
Les fosfolipases A2 (PLA2s) de les serps del gènere Bothrops són un dels principals responsables de la necrosi muscular en l'enverinament, una conseqüència no neutralitzada per l'administració de sèrum antiofídic. Aquestes proteïnes són miotòxiques pel seu efecte disruptiu sobre la membrana fosfolipídica, bé per un mecanisme catalític dependent de calci o bé per un mecanisme no depenent de calci poc descrit a la bibliografia. En general, les toxines de serp es purifiquen directament de la seva font natural, el verí extret, i la purificació és un repte a causa de la coexistència de diverses isoformes. Els objectius d'aquesta tesi van ser entendre el mecanisme no catalític de pertorbació de la membrana mitjançant l'estudi de miotoxines de serp i proposar un nou mètode cristal·logràfic per fer front a les mostres impures, anomenat SEQUENCE SLIDER. Es van realitzar estudis estructurals de cristal·lografia de raigs X, complementats amb altres tècniques biofísiques, com SAXS (dispersió de raigs X d'angle petit), amb tres miotoxines en estat apo i acomplexades amb productes naturals i inhibidors. Hem proposat mesuraments locals i globals per caracteritzar i relacionar aquests estats amb la funció de la toxina. Amb el mètode SEQUENCE SLIDER, hem facilitat l'elucidació de les estructures amb seqüència parcial coneguda mitjançant l'avaluació de diferents cadenes laterals contra el coeficient de correlació de l'espai real calculat a partir de dades de difracció. D'altra banda, hem desenvolupat SEQUENCE SLIDER per augmentar l'abast del programa ARCIMBOLDO amb resolució més baixa que l'habitual de 2 Å. En aquests casos s'avaluen simultàniament diferents hipòtesis de seqüències de les traces parcials de polialanina i es proven mitjançant l'autotraçat fins que l'estructura sigui resolta. Hem millorat la comprensió del mecanisme miotòxic i hem desenvolupat un mètode de solució estructural per a estructures cristal·logràfiques desafiants.
Phospholipases A2 (PLA2s) are one of the main component of Bothrops genus snakes and one of the main responsible for muscular necrosis in envenomation, a consequence not neutralized by administration of antiophidian serum. These proteins are myotoxic by disrupting membrane phospholipids by a catalytic mechanism dependent of calcium or by perturbing membrane integrity by an independent of calcium mechanism not fully known. Usually, snake toxins are purified directly from the natural source, extracted venom, and purity is a challenge due to the co-existence of various isoforms. The objectives of this thesis were to understand the non-catalytic membrane perturbation mechanism by studying the snake myotoxins and to propose a new crystallographic method to deal with impure samples, called SEQUENCE SLIDER. We performed structural X-ray crystallography studies, complemented with other biophysical techniques, such as small-angle X-ray scattering, with three bothropic myotoxins in apo state and complexed to natural products and inhibitors. We proposed local and global measurements to characterize and relate these states to toxin function. With the method SEQUENCE SLIDER, we aided elucidation of structures with partial sequence known by evaluating different side chain against real space correlation coefficient calculated from diffraction data. Furthermore, we developed SEQUENCE SLIDER to increase the scope of the crystallographic phasing program ARCIMBOLDO to lower resolution than the usual 2 Å. In such cases, different hypotheses of sequences of the partial traces of polyalanine are evaluated simultaneously and pushed through autotracing until the structure is phased. We improved the myotoxic mechanism comprehension and developed a structure solution method for challenging crystallographic structures.
Les fosfolipases A2 (PLA2s) de les serps del gènere Bothrops són un dels principals responsables de la necrosi muscular en l'enverinament, una conseqüència no neutralitzada per l'administració de sèrum antiofídic. Aquestes proteïnes són miotòxiques pel seu efecte disruptiu sobre la membrana fosfolipídica, bé per un mecanisme catalític dependent de calci o bé per un mecanisme no depenent de calci poc descrit a la bibliografia. En general, les toxines de serp es purifiquen directament de la seva font natural, el verí extret, i la purificació és un repte a causa de la coexistència de diverses isoformes. Els objectius d'aquesta tesi van ser entendre el mecanisme no catalític de pertorbació de la membrana mitjançant l'estudi de miotoxines de serp i proposar un nou mètode cristal·logràfic per fer front a les mostres impures, anomenat SEQUENCE SLIDER. Es van realitzar estudis estructurals de cristal·lografia de raigs X, complementats amb altres tècniques biofísiques, com SAXS (dispersió de raigs X d'angle petit), amb tres miotoxines en estat apo i acomplexades amb productes naturals i inhibidors. Hem proposat mesuraments locals i globals per caracteritzar i relacionar aquests estats amb la funció de la toxina. Amb el mètode SEQUENCE SLIDER, hem facilitat l'elucidació de les estructures amb seqüència parcial coneguda mitjançant l'avaluació de diferents cadenes laterals contra el coeficient de correlació de l'espai real calculat a partir de dades de difracció. D'altra banda, hem desenvolupat SEQUENCE SLIDER per augmentar l'abast del programa ARCIMBOLDO amb resolució més baixa que l'habitual de 2 Å. En aquests casos s'avaluen simultàniament diferents hipòtesis de seqüències de les traces parcials de polialanina i es proven mitjançant l'autotraçat fins que l'estructura sigui resolta. Hem millorat la comprensió del mecanisme miotòxic i hem desenvolupat un mètode de solució estructural per a estructures cristal·logràfiques desafiants.
Descrição
Palavras-chave
Biologia molecular estrutural, Veneno de serpente, Fosfolipases A2 homólogas, Faseamento, Arcimboldo, Structural molecular biology, Phospholipases A2-like proteins, Snake venom, Phasing, Biologia molecular estructural, Verí de serp